【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于再生醫(yī)學(xué)，具體涉及ipsc細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、頭發(fā)是個人美和自尊的象征，在日常生活中起著至關(guān)重要的作用。然而，由于遺傳、疾病、壓力和衰老等諸多因素引起的白發(fā)問題，使越來越多人受到困擾。盡管已知白發(fā)極大地影響人們的心理健康和社會生活，但除了染發(fā)劑之外(染發(fā)劑的使用與患癌癥風(fēng)險有正相關(guān)關(guān)系)，缺乏有效的對策。
2、人類的毛發(fā)生長周期是3-5年，約10個周期后毛發(fā)開始變白。白發(fā)可分為生理性白發(fā)和病理性白發(fā)兩種，毛發(fā)并非自我突變?yōu)榘咨窃撝芷谛律拿l(fā)內(nèi)黑素細(xì)胞合成的黑素減少或缺如所致。如壓力引起交感神經(jīng)神經(jīng)釋放去甲腎上腺素使黑色素細(xì)胞過度分裂而耗竭，衰老性白發(fā)是由于黑色素干細(xì)胞被卡住，不能正確沿毛發(fā)上下移動接收正確信號進(jìn)而分化為黑色素細(xì)胞，白發(fā)的形成機(jī)制雖有許多假設(shè)，但從根本上都是由毛囊內(nèi)黑素干細(xì)胞(mcscs)及其譜系的失衡所引起。如mcscs的減少及其穩(wěn)態(tài)的破壞，黑素細(xì)胞移行能力的喪失，毛發(fā)周期中生長期的缺失，黑素細(xì)胞的凋亡，黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)以及黑素體合成障礙等。然而，作為黑素細(xì)胞再生的核心，作為整個色素循環(huán)的源泉，mcscs自我維持更新的能力一旦被破壞，后續(xù)黑素細(xì)胞譜系最終都將喪失功能，且不能恢復(fù)。因此，mcscs的穩(wěn)態(tài)被破壞是白發(fā)形成的關(guān)鍵。
3、毛囊是一個由多種細(xì)胞類型組成的控制毛發(fā)生長的皮膚附屬器官，是毛干的“發(fā)源地”。毛囊的隆起和毛胚區(qū)含有兩組干細(xì)胞：上皮組織來源的毛囊干細(xì)胞(hfscs)和神經(jīng)嵴來源的黑素干細(xì)胞(mescs)。作為色素細(xì)胞循環(huán)的“補(bǔ)
4、原代黑色素細(xì)胞雖然可以從個體皮膚或毛囊組織中分離培養(yǎng)，但一是其體外擴(kuò)增能力有限，二是容易受成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的污染使培養(yǎng)成功率不高，三是個體化制備成本太高，不利于將來臨床推廣應(yīng)用。
5、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced?pluripotent?stem?cells，ipscs)是2006年由日本京都大學(xué)山中伸彌(shinya?yamanaka)教授的一項(xiàng)諾獎技術(shù)，即將四個轉(zhuǎn)錄因子oct3/4、sox2、c-myc和klf4引入體細(xì)胞(如皮膚成纖維細(xì)胞)，誘導(dǎo)其發(fā)生重編程后所產(chǎn)生的細(xì)胞無論在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸胎瘤生成能力、還是三胚層分化能力等方面均與胚胎干細(xì)胞極為相似，所以被稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。正是因?yàn)閕psc體外強(qiáng)大的擴(kuò)增能力和多潛能分化能力，已經(jīng)被用作產(chǎn)生多種功能細(xì)胞的種子細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、免疫細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元、肝樣細(xì)胞、血小板、胰島細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等。由于療效的肯定，多項(xiàng)ipsc細(xì)胞來源的細(xì)胞生物新藥研發(fā)已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，如用于治療帕金森癥、糖尿病和年齡相關(guān)性黃斑變性等。
6、ipsc細(xì)胞hla單體型建庫(haplobanking)目的是用最少的細(xì)胞系給較高比例的人群配型，從而避免將來同種異體干細(xì)胞移植時發(fā)生排斥反應(yīng)或減少抗免疫排斥藥物的使用。例如英國學(xué)者taylor的研究表明需從1萬個人中篩選的10個hla-a、hla-b和hla-dr純合供體，用他們的體細(xì)胞重編程ipsc細(xì)胞建成細(xì)胞庫，能夠?yàn)橹辽?7.7％的英國人提供hla表型匹配的干細(xì)胞。如果要為93％的英國人提供匹配的干細(xì)胞則需要建150個hla表型高配細(xì)胞系。nakatsuji的研究表明從1萬5千人中篩選了30個純合供體建系，能夠與82.2％的日本人相配型，從2萬4千人中篩選的50個純合供體建系可以將這一比例提高至90.7％。以上的國際研究都只是針對hla-a、hla-b和hla-dr三個基因座，我們的設(shè)計是根據(jù)同樣原理但是將hla增加到a-b-cw-dq-dr5個基因座，進(jìn)一步提升配型的精度和降低潛在排斥反應(yīng)。
7、鑒于以上原因，本專利技術(shù)的目的是用hla單體高配型ipsc細(xì)胞經(jīng)體外定向分化，大規(guī)模制備黑色素細(xì)胞，以用于同種異體移植臨床白發(fā)轉(zhuǎn)黑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為克服上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供了ipsc細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方法及其應(yīng)用，先建立hla單體高配型ipsc細(xì)胞株，然后建立有效向黑色素細(xì)胞定向分化的方法，從而大規(guī)模制備黑色素細(xì)胞。
2、本專利技術(shù)采用下述技術(shù)方案：
3、ipsc細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方法，包括以下：
4、s1.使用stempro?accutase細(xì)胞解離液(thermofisher)消化ipsc細(xì)胞株1–2min，收集細(xì)胞團(tuán)塊；
5、s2.室溫離心細(xì)胞，用neurobasal/ham’s?f12(ratio?1:1)培養(yǎng)基(添加1％of?n-2；2％不含維生素a的b-27，thermofisher)輕輕重懸細(xì)胞保持團(tuán)塊；
6、s3.把細(xì)胞團(tuán)塊轉(zhuǎn)移到低吸附孔板中形成擬胚體，并在培養(yǎng)基里添加chir-99021,ldn-193189,sb?431542，培養(yǎng)4天，誘導(dǎo)擬胚體向神經(jīng)脊譜系方向分化；
7、s4.在神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基里添加chir99021,edn3,scf,of?human?recombinant?bmp4和ascorbic?acid，繼續(xù)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)3天；
8、s5.從第7天到第30天，擬胚體轉(zhuǎn)移到gelatine包被的孔板，用添加了chir99021,edn3,scf,of人重組bmp4,和ascorbic?acid的黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基mgm-4培養(yǎng)，向黑色素細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化；
9、s6.細(xì)胞長滿用0.05％trypsin傳代，用添加了20μm?forskolin的黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基連續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)2代；
10、s7.從第3代開始，分化獲得的黑素細(xì)胞在不含任何添加物的mgm-4培養(yǎng)基中連續(xù)傳代至20代；
11、s8.黑色素細(xì)胞鑒定后，離心取黑色沉淀獲得黑色素細(xì)胞。
12、優(yōu)選的，所用的ipsc細(xì)胞株的制備過程為：
13、s01.篩選a*3001-cw*0602-b*1302-drb1*0701-dqb1*0202?5個串聯(lián)基因座的10個位點(diǎn)純合的單倍型組合的臍血分離單核細(xì)胞用于重編程制備ipsc細(xì)胞；
14、s02.用stempro-34無血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)單核細(xì)胞；
15、s03.使用仙臺病毒重編程試劑盒，加入klf4、oct4和sox2(kos)病毒和c-myc病毒，在37℃下孵育，對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)；
16、s04.1天后洗去仙臺病毒，細(xì)胞繼續(xù)在stempro-34培養(yǎng)；
17、s05.使用stempro-34完全培養(yǎng)基在geltrex基質(zhì)包被培養(yǎng)皿上進(jìn)行細(xì)胞鋪板，連續(xù)培養(yǎng)；
1本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.iPSC細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的iPSC細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方法，其特征在于，所用的iPSC細(xì)胞株的制備過程為：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的iPSC細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方法，其特征在于，S02中，用1ml?StemPro-34無血清完全培養(yǎng)基在24孔板1個孔中培養(yǎng)來自臍血的單核細(xì)胞，細(xì)胞濃度為2.5×105–5×105個細(xì)胞/mL，培養(yǎng)1天。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的iPSC細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方法，其特征在于，S03為:從–80℃的儲存設(shè)備中取出一組CytoTune-iPS2.0仙臺病毒重編程試劑盒，加入1ml?MOI＝5的Klf4、Oct4和Sox2(KOS)病毒和MOI＝5c-Myc病毒，將細(xì)胞鋪于12孔組織培養(yǎng)板中，并在37℃下孵育過夜，以此進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的所述的iPSC細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方法，其特征在于，S04中，在StemPro-34培養(yǎng)2天；S05中，連續(xù)培養(yǎng)7天并且每天進(jìn)行半換液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的iPS
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的iPSC細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方法，其特征在于，S8中，黑色素細(xì)胞鑒定采用用免疫熒光染色法證明分化而得的黑色素細(xì)胞表達(dá)典型標(biāo)志物MITF和TYRP1。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的iPSC細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方法在同種異體移植臨床白發(fā)轉(zhuǎn)黑方面的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.ipsc細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ipsc細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方法，其特征在于，所用的ipsc細(xì)胞株的制備過程為：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ipsc細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方法，其特征在于，s02中，用1ml?stempro-34無血清完全培養(yǎng)基在24孔板1個孔中培養(yǎng)來自臍血的單核細(xì)胞，細(xì)胞濃度為2.5×105–5×105個細(xì)胞/ml，培養(yǎng)1天。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ipsc細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方法，其特征在于，s03為:從–80℃的儲存設(shè)備中取出一組cytotune-ips2.0仙臺病毒重編程試劑盒，加入1ml?moi＝5的klf4、oct4和sox2(kos)病毒和moi＝5c-myc病毒，將細(xì)胞鋪于12孔組織培養(yǎng)板中，并在37℃下孵育過夜，以此進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的所述的ipsc細(xì)胞株分化為黑色素細(xì)胞的方...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：于鳳剛，劉艷飛，
申請(專利權(quán))人：蘇州華原細(xì)胞生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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