【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種病原菌的分離純化及鑒定方法，尤其涉及一種茶餅病病原菌的分離純化及鑒定方法，屬于農作物植物保護。
技術介紹
1、茶餅病是一種危害茶樹嫩梢嫩葉的重要病害，近年來隨著產業結構的調整和種植水平不斷提高，茶餅病的發生逐漸加重，每年因茶餅病的發生為害減產20%?-?30%。病葉制成的干茶味苦異常，葉底渾暗，品質較差，會嚴重影響茶葉的經濟效益。從發病組織中成功分離和獲得目標病原菌是植物病理學研究及病害防治的關鍵環節，而現有技術對茶餅病病原菌的分離純化難度較大，容易受到雜菌的影響，無法快速而準確地獲得茶餅病病原菌。采用現有技術對茶餅病病原菌的分離純化的難點及復雜性主要體現在以下幾個方面：
2、分離難點：茶餅病的病原菌是壞損外擔菌，?屬于擔子菌亞門真菌。?這種病原菌在自然界中生長異常緩慢，在漫長的生長周期中，茶樹葉片很容易感染其它真菌，從而?增加了分離的難度。?
3、環境因素：?茶餅病不同于一般的茶樹葉部病害，主要發生在茶樹的嫩葉和嫩莖上，?這些部位的組織較為脆弱，同時病斑的形成和發展受到環境因素的影響較大，需要低溫高濕，當溫度超過30℃，病原菌的存活和傳播就會受影響，?從而影響分離效果。?
4、分離技術的復雜性：?茶餅病的病原菌分離與普通病原真菌的分離不一樣，該菌的分離需要充分利用成熟擔孢子彈射的特性，而不是簡單的將發病組織置于培養基上培養，?這些技術要求操作人員有一定的專業知識背景。?此外，茶餅病?病原菌的生長狀態對分離有較大的影響，不同時期的擔孢子彈射能力不一樣，這些因素?增加了分離的難
5、分離培養基的不同：茶餅病的病原菌在普通pda培養基上萌發率較低，分離壞損外擔菌時，需要在pda培養基中添加茶汁，操作繁瑣，分離效果不佳。
6、一直以來都缺乏一種培養效率高，能最大程度避免受到雜菌影響，能分離純化效率高，便于鑒定的方法來解決上述技術問題。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是針對現有技術對茶餅病病原菌的分離純化難度較大，萌發率較低，而且容易受到雜菌的影響，操作繁瑣，分離效果不佳，無法快速而準確地獲得茶餅病病原菌的缺陷和不足，現提供一種操作方便，提高了培養效率，內生菌的污染以及受到雜菌的影響的概率極低，極大地降低了對茶餅病病原菌的分離純化難度，分離純化效率高，便于鑒定的一種茶餅病病原菌的分離純化及鑒定方法。
2、為實現上述專利技術目的，本專利技術的技術解決方案是：一種茶餅病病原菌的分離純化及鑒定方法，包括以下步驟：
3、s1、病樣采集：茶園采集病葉，將病葉放入采集袋中，低溫保存，帶回實驗室；
4、s2、病葉預處理：在采摘的病葉種選取部分較幼嫩、生命力旺盛，沒有被其他真菌污染的處于發病早期的病葉，用流動自來水沖洗5分鐘-10分鐘，在無菌操作臺上用滅菌手術刀在病健交界處切取5mm×5mm的新鮮病斑組織，于無菌培養皿中消毒后并漂洗；
5、s3、病原菌分離：將漂洗好的葉片背面朝下粘于pda平板蓋上，于培養箱25攝氏度正置光照培養，讓孢子自由彈落；
6、s4、挑菌絲純化培養：利用成熟擔孢子彈射的特性，直接將發病組織固定在培養皿蓋上進行分離培養，培養20天左右，待菌絲呈白色天鵝絨狀略具光澤時，在菌落邊緣輕輕挑取菌絲尖端移至新鮮茶汁pda平板上進行純化培養；
7、s5、病原菌驗證：將獲得的純化茶餅病病原菌打孔，接種至茶樹嫩葉上，保溫保濕培養，直至出現茶餅病病害癥狀，并產生白色子實層，然后從發病的離體葉片病斑上再重新分離得到茶餅病病原菌菌株；
8、s6、病原菌dna提取：采用真菌基因組dna快速提取試劑盒提取dna，沉淀加入合適體積的無菌雙蒸水或te緩沖液，4℃保存備用或放入-20℃長期保存；
9、s7、pcr擴增：采用基因組轉錄間隔區通用引物its1和its4對病原菌rdna-its區進行pcr擴增；
10、s8、pcr鑒定：將pcr擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5×tbe緩沖液中電泳，eb染色后置于凝膠成像儀上獲取pcr產物分離情況，若為茶餅病病原菌則在540bp附近有特異的擴增條帶。
11、進一步的，所述s2步驟中對無菌培養皿中消毒采用75%酒精消毒3次，每次30秒；消毒后漂洗時每次酒精消毒后用無菌水漂洗3次，每次1分鐘。
12、進一步的，所述s4步驟中培養箱的溫度設置為15-32℃。
13、進一步的，所述s4步驟中培養箱的最適溫度為25℃。
14、進一步的，所述s7步驟中pcr擴增的反應體系為25μl：pcr?buffer2.5μl，引物各1μl，dna模板1μl，taqdna聚合酶0.4μl，dntp?0.5μl,用ddh2o補到25μl。
15、進一步的，所述s7步驟中pcr擴增反應程序為第一循環94℃預變性4分鐘；然后94℃變性45秒，54℃退火45秒，54℃延伸45秒，共進行35個循環；最后72℃延伸10分鐘。
16、進一步的，所述s8步驟中電泳的電壓為4-5v/cm。
17、本專利技術的有益效果是：
18、1、本專利技術充分利用了成熟擔孢子彈射的特性，直接將發病組織固定在培養皿蓋上進行分離培養，內生菌的污染以及受到雜菌的影響的概率極低，提高了培養效率，而且可確保為茶餅病病原菌。
19、2、本專利技術通過基因組轉錄間隔區通用引物its1和its4對病原菌rdna-its區進行pcr擴增確認，增強了目標菌株的選擇性，可以快速鑒別病原菌。
20、3、本專利技術操作方便，極大地降低了對茶餅病病原菌的分離純化難度，分離純化效率高，可準確地獲得目標病原，為后續研究奠定堅實基礎，一般的科技人員也十分容易掌握本方法。
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1.一種茶餅病病原菌的分離純化及鑒定方法，其特征在于包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種茶餅病病原菌的分離純化及鑒定方法，其特征在于：所述S2步驟中對無菌培養皿中消毒采用75%酒精消毒3次，每次30秒；消毒后漂洗時每次酒精消毒后用無菌水漂洗3次，每次1分鐘。
3.根據權利要求1所述的一種茶餅病病原菌的分離純化及鑒定方法，其特征在于：所述S4步驟中培養箱的溫度設置為15-32℃。
4.一種權利要求3所述的一種茶餅病病原菌的分離純化及鑒定方法，其特征在于：所述S4步驟中培養箱的最適溫度為25℃。
5.一種權利要求1所述的一種茶餅病病原菌的分離純化及鑒定方法，其特征在于：所述S7步驟中PCR擴增的反應體系為25μL：PCR?Buffer2.5μl，引物各1μL，DNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.4μL，dNTP?0.5μL,用ddH2O補到25μL。
6.一種權利要求1所述的一種茶餅病病原菌的分離純化及鑒定方法，其特征在于：所述S7步驟中PCR擴增反應程序為第一循環94℃預變性4分鐘；然后94℃變性45秒，54℃
7.一種權利要求1所述的一種茶餅病病原菌的分離純化及鑒定方法，其特征在于：所述S8步驟中電泳的電壓為4-5V/cm。
...【技術特征摘要】
1.一種茶餅病病原菌的分離純化及鑒定方法，其特征在于包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種茶餅病病原菌的分離純化及鑒定方法，其特征在于：所述s2步驟中對無菌培養皿中消毒采用75%酒精消毒3次，每次30秒；消毒后漂洗時每次酒精消毒后用無菌水漂洗3次，每次1分鐘。
3.根據權利要求1所述的一種茶餅病病原菌的分離純化及鑒定方法，其特征在于：所述s4步驟中培養箱的溫度設置為15-32℃。
4.一種權利要求3所述的一種茶餅病病原菌的分離純化及鑒定方法，其特征在于：所述s4步驟中培養箱的最適溫度為25℃。
5.一種權利要求1所述的一種茶餅病病原菌的分...
【專利技術屬性】
技術研發人員：譚榮榮，毛迎新，焦龍，黃丹娟，陳勛，王紅娟，
申請(專利權)人：湖北省農業科學院果樹茶葉研究所，
類型：發明
國別省市：
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