本發明專利技術涉及一種碳酸酐酶純度的檢測方法，屬于酶檢測分析技術領域。本發明專利技術所提供的碳酸酐酶純度的檢測方法為：制備待測樣液，采用反相液相色譜法分析得到色譜圖、計算得到碳酸酐酶的純度；其中流動相分別采用含氯化鈉濃度、甲酸的水溶液，和含氯化鈉濃度、甲酸的水溶液與乙腈的混合液，經特定的洗脫條件洗脫分離。采用本發明專利技術的檢測方法可實現在20min內快速檢測得到樣品中碳酸酐酶的純度，結果準確度高、方法的精密度好、耐用性好，且能夠很好地分離牛血清白蛋白、重組碳酸酐酶和牛血紅蛋白，并實現多種不同來源碳酸酐酶的檢測，在碳酸酐酶產品質控中有很高的應用價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及酶檢測分析，尤其涉及一種碳酸酐酶純度的檢測方法。
技術介紹
1、碳酸酐酶是一種含zn2+的金屬酶，自然界中最為活躍的酶之一，反應常數高達106s-1，由于其擁有對重金屬敏感、能催化co2可逆水合反應的能力及酯酶活性，且在生物體內承擔著多種生理學功能，參與多種離子交換、維持機體內環境穩態，已被廣泛應用于環境檢測、co2捕集轉化、生物傳感器及臨床醫療等領域。
2、碳酸酐酶的純度檢測是碳酸酐酶產品質量控制的重要一環，聚丙烯酰胺凝膠電泳和高效液相色譜法是常用的兩種檢測方法。聚丙烯酰胺凝膠電泳根據蛋白質分子不同的相對分子質量所產生不同的遷移率將蛋白質分離，通過蛋白條帶是否存在雜帶以及目的條帶顏色的深淺來鑒定碳酸酐酶純度。傳統的聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟繁瑣、耗時長、檢測干擾因素較多，對人員操作水平要求較高，且無法檢出與碳酸酐酶分子量相近的雜質。而高效液相色譜法利用蛋白質分子不同極性的特性與固定相作用存在差異，使其在色譜柱中的保留時間不同，達到色譜峰分離效果，通過色譜圖的峰型和峰面積進行純度鑒定，具有操作簡便、分辨率高、靈敏度高、重復性好、分析結果更準確等優點。
3、現有檢測碳酸酐酶純度的高效液相色譜方法參考《介質表面蛋白偶聯位點質譜法識別與應用》一文，選擇乙腈和三氟乙酸作為流動相，采用梯度洗脫方式，可較好地分離碳酸酐酶并檢測其純度，但該方法缺乏專屬性、精密度、耐用性等方法學考察，有待進一步驗證，且檢測時長達60分鐘，存在耗時長、檢測成本高、效率低的缺點，不能滿足大規模的碳酸酐酶純度檢測需求。
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p>4、因此，開發一種高效、準確、適用性廣、可實現良好分離效果的液相色譜法來滿足碳酸酐酶純度檢測要求，是碳酸酐酶產品質量控制的迫切需求，在產業中有很高的應用價值。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于克服現有技術的不足之處而提供一種碳酸酐酶純度的檢測方法。本專利技術所提供的檢測方法具有良好的專屬性、精密度、耐用性，結果準確可靠，同時檢測時間短、效率高，更能滿足實際的應用需求。
2、為實現上述目的，本專利技術采取的技術方案為：
3、第一方面，本專利技術提供了一種碳酸酐酶純度的檢測方法，包括以下步驟：
4、(1)將待測樣品溶于溶劑得到樣液，采用反相液相色譜法分析所述樣液，得到色譜圖；所述反相液相色譜法的洗脫條件如下：
5、在0-10min，控制流動相a與流動相b的體積比從30：70變化至0：100進行梯度洗脫；在10.01-20min，控制流動相a與流動相b的體積比為30：70進行等度洗脫；
6、所述流動相a為氯化鈉濃度0.1-0.15mol/l、甲酸體積含量0.02-0.07％的水溶液；所述流動相b為溶液b與乙腈的混合液，所述溶液b為氯化鈉濃度0.1-0.15mol/l、甲酸體積含量0.05-0.15％的水溶液，所述溶液b與乙腈的體積比為1：(0.9-1.1)；
7、(2)分析所述色譜圖，得到所述待測樣品中碳酸酐酶的純度。
8、本專利技術針對碳酸酐酶產品的質控檢測問題，提供了一種以反相液相色譜法為核心的碳酸酐酶純度的檢測方法。本專利技術優化了液相色譜洗脫分離的流動相體系，采用流動性a為含有0.1-0.15mol/l氯化鈉溶液、0.02-0.07％v/v甲酸的水溶液；流動相b為含有0.1-0.15mol/l氯化鈉溶液、0.05-0.15％v/v甲酸的水溶液與乙腈的混合液，按照上述的梯度洗脫方式，只需不到20分鐘即可完全洗脫分離出碳酸酐酶、從而分析得到其純度。
9、本專利技術所采用的流動相及洗脫條件能夠實現重組碳酸酐酶與牛血紅蛋白和牛血清白蛋白的徹底分離，排除雜質干擾，對碳酸酐酶專屬性較強、準確度高，滿足碳酸酐酶純度檢測的基本要求；同時，可避免溶劑峰對檢測結果的影響，實現檢測結果更高的準確度。此外，本方法的對不同來源碳酸酐酶的分辨效果優異，可根據保留時間的差異分離從不同來源提取的碳酸酐酶(比如，牛碳酸酐酶、豬碳酸酐酶)，適用性廣。
10、本專利技術提供的碳酸酐酶純度的檢測方法具有良好的精密度和耐用性，當流動相在限定范圍內發生變動、或其他檢測條件發生一定變化時，碳酸酐酶純度的檢測結果基本不受影響，各參數變動條件下的主峰純度的rsd均小于2％；同時，本專利技術方法的檢測準確度高、專屬性好，能夠實現重組碳酸酐酶與雜質的完全分離、以及實現分離檢測不同來源提取的碳酸酐酶樣品。
11、使用本專利技術提供的碳酸酐酶純度的檢測方法能得到較為精確且可靠的檢測數據，滿足碳酸酐酶產品質量控制要求，同時具備操作簡便、檢測成本低、耗時短、檢測效率高等優點，具有很高的實際應用價值。
12、優選地，所述步驟(1)中，待測樣品的質量與所述樣液的體積比為(0.5-1.5)mg：(0.8-1.2)ml。
13、優選地，所述步驟(1)中，所述溶劑為水。
14、優選地，所述反相液相色譜法采用c18反相色譜柱，所述色譜柱的規格為4.6mm×250mm，粒度為5μm，孔徑為本專利技術反相液相色譜法所采用的色譜柱沒有特殊需求，具備同等性能即可。
15、優選地，所述反相液相色譜法的檢測波長為220-280nm。
16、優選地，所述反相液相色譜法中，所述樣液的進樣量為10-20μl。
17、優選地，所述反相液相色譜法的洗脫流速為0.8-1.2ml/min。
18、優選地，所述反相液相色譜法中，色譜柱的柱溫為25-35℃。
19、本專利技術的碳酸酐酶純度的檢測方法在上述的條件范圍內變動時，色譜圖中碳酸酐酶的主峰純度基本不受影響，均可以得到較為準確可靠的結果，方法的耐用度良好。
20、進一步優選地，所述反相液相色譜法中，檢測波長為280nm，樣液的進樣量為20μl，洗脫流速為1.0ml/min，色譜柱的柱溫為30℃。
21、優選地，所述步驟(2)中，采用面積歸一化法分析所述色譜圖。
22、本專利技術采用面積歸一化法，能高效分析純度較高的碳酸酐酶產品，適用于大規模生產中對碳酸酐酶產品質控的快速檢測需求。
23、第二方面，本專利技術提供了上述碳酸酐酶純度的檢測方法在碳酸酐酶產品質控中的用途。
24、與傳統的聚丙烯酰胺凝膠電泳法相比，本專利技術提供的方法操作簡便，耗時短，分辨率高，干擾因素少，精密度與重復性好，可連續進樣進行檢測，檢測準確度與檢測效率都明顯更佳；與現有的檢測碳酸酐酶的高效液相色譜技術相比，本專利技術所需的檢測時間極大縮短，檢測效率明顯提升，既節省了流動相消耗，又減少了檢測時間成本。本專利技術所提供的碳酸酐酶純度的檢測方法應用于大規模生產質控中，可以很好地分離產品中的雜質、檢測效率高，可實現快速檢出雜質含量高的純度不合格品。
25、與現有技術相比，本專利技術的有益效果為：
26、本專利技術的碳酸酐酶純度的檢測方法，提供了一種優化的反相液相色譜法，實現了碳酸酐酶純度的高效檢測，方法耐用性高、精密度好；通過控制特定的流動相本文檔來自技高網
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【技術保護點】
1.一種碳酸酐酶純度的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述碳酸酐酶純度的檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，待測樣品的質量與所述樣液的體積比為(0.5-1.5)mg：(0.8-1.2)mL。
3.如權利要求1所述碳酸酐酶純度的檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述溶劑為水。
4.如權利要求1所述碳酸酐酶純度的檢測方法，其特征在于，所述反相液相色譜法采用C18反相色譜柱，所述色譜柱的規格為4.6mm×250mm，粒度為5μm，孔徑為
5.如權利要求1所述碳酸酐酶純度的檢測方法，其特征在于，所述反相液相色譜法的檢測波長為220-280nm。
6.如權利要求1所述碳酸酐酶純度的檢測方法，其特征在于，所述反相液相色譜法中，所述樣液的進樣量為10-20μL。
7.如權利要求1所述碳酸酐酶純度的檢測方法，其特征在于，所述反相液相色譜法的洗脫流速為0.8-1.2mL/min。
8.如權利要求1所述碳酸酐酶純度的檢測方法，其特征在于，所述反相液相色譜法中，色譜柱的柱溫為25-35℃。
9.如權利要求1所述碳酸酐酶純度的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中，采用面積歸一化法分析所述色譜圖。
10.如權利要求1-9任一項所述碳酸酐酶純度的檢測方法在碳酸酐酶產品質控中的用途。
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【技術特征摘要】
1.一種碳酸酐酶純度的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述碳酸酐酶純度的檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，待測樣品的質量與所述樣液的體積比為(0.5-1.5)mg：(0.8-1.2)ml。
3.如權利要求1所述碳酸酐酶純度的檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述溶劑為水。
4.如權利要求1所述碳酸酐酶純度的檢測方法，其特征在于，所述反相液相色譜法采用c18反相色譜柱，所述色譜柱的規格為4.6mm×250mm，粒度為5μm，孔徑為
5.如權利要求1所述碳酸酐酶純度的檢測方法，其特征在于，所述反相液相色譜法的檢測波長為22...
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡偉江，李露，張義，趙梟健，
申請(專利權)人：云錦華彰珠海生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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