【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及代謝工程，尤其涉及一種副產(chǎn)物消除的赤霉素高產(chǎn)菌、其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、赤霉素（gibberellin?acid，ga3）是由植物、部分真菌合成的一種植物生長激素。因其特殊的刺激植物生長的能力被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、園藝與釀酒生產(chǎn)。ga3是一種四環(huán)二萜羧酸，分子式c19h22o6，分子量346.37，熔點233?~?235?℃，易溶于醇類、丙酮、乙酸乙酯、碳酸氫鈉溶液以及ph為6.2的磷酸緩沖液，難溶于水和乙醚。ga3作為一種次級代謝產(chǎn)物，一般通過液態(tài)發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵與植物提取的方式獲得。目前ga3的生產(chǎn)主要依賴液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵。
2、在真菌代謝過程中，同一種初級代謝的前體可以得到多種次級代謝產(chǎn)物，從乙酰輔酶a開始的，經(jīng)代謝可以得到包括ga3、比卡菌素（bikaverin）和鐮刀菌素（fusarubins）等在內(nèi)的次級代謝產(chǎn)物。因而，在微生物發(fā)酵生產(chǎn)ga3時，往往會伴隨著得到副產(chǎn)物比卡菌素和鐮刀菌素。在發(fā)酵過程中，副產(chǎn)物比卡菌素和鐮刀菌素的產(chǎn)生通過競爭性的利用共用前體，降低赤霉素途徑的代謝通量，這使得在大規(guī)模生產(chǎn)中增加目標產(chǎn)物的ga3純化難度和生產(chǎn)成本。
3、比卡菌素基因簇大小約為17?kb，即，bik1、bik2、bik3、bik4、bik5和bik6，鐮刀菌素基因簇大小約為16.8?kb，即，fsr1、fsr2、fsr3、fsr4、fsr5和fsr6。敲除兩個副產(chǎn)物基因簇難度較大。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決副產(chǎn)物比卡菌素和鐮刀菌素
2、本專利技術(shù)的具體技術(shù)方案為：
3、第一方面，本專利技術(shù)提供了一種副產(chǎn)物消除的赤霉素高產(chǎn)菌，其由同時敲除比卡菌素基因簇和鐮刀菌素基因簇得到。
4、作為優(yōu)選，底盤菌為藤倉赤霉菌( fusariumfujikuroi)?cctcc?no:m?2019378。
5、作為優(yōu)選，比卡菌素基因簇的ncbi登陸號為nc_036626.1?(102202..119287)。鐮刀菌素基因簇核苷酸序列位于滕倉赤霉菌五號染色體。
6、作為優(yōu)選，鐮刀菌素基因簇的ncbi登陸號為nc_036623.1(4286817..4303612)。鐮刀菌素基因簇核苷酸序列位于滕倉赤霉菌二號染色體。
7、第二方面，本專利技術(shù)提供了上述赤霉素高產(chǎn)菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
8、構(gòu)建含有比卡菌素基因簇敲除框、鐮刀菌素基因簇敲除框的crispr-cas9質(zhì)粒pff332-δ bikδ fsr，將pff332-δ bikδ fsr導(dǎo)入底盤菌藤倉赤霉菌中，得到所述赤霉素高產(chǎn)菌。
9、pff332作為質(zhì)粒載體，可以通過現(xiàn)有技術(shù)獲得，如市場購買。
10、作為優(yōu)選，比卡菌素基因簇敲除框的制備方法為：取 bik1基因的供體dna序列片段、比卡菌素基因簇的上游核苷酸序列片段和比卡菌素基因簇的下游核苷酸序列片段進行融合pcr，其中：
11、 bik1基因的供體dna序列如?seq?id?no.1所示，比卡菌素基因簇的上游核苷酸序列如seq?id?no.2所示，比卡菌素基因簇的下游核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
12、作為優(yōu)選，鐮刀菌素基因簇敲除框的制備方法包括以下步驟：取 fsr1基因的供體dna序列片段、鐮刀菌素基因簇的上游核苷酸序列片段和鐮刀菌素基因簇的下游核苷酸序列片段進行融合pcr，其中：
13、 fsr1基因的供體dna序列如?seq?id?no.4所示，鐮刀菌素基因簇的上游核苷酸序列如seq?id?no.5所示，鐮刀菌素基因簇的下游核苷酸序列如seqid?no.6所示。
14、作為優(yōu)選，所述藤倉赤霉菌的保藏編號為cctcc?no：m?2019378。
15、第三方面，本專利技術(shù)提供了上述赤霉素高產(chǎn)菌在發(fā)酵生產(chǎn)赤霉素中的應(yīng)用。
16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下技術(shù)效果：
17、本專利技術(shù)通過crispr-cas9基因編輯技術(shù)，實現(xiàn)了比卡菌素和鐮刀菌素基因簇的同時敲除，由此消除了藤倉赤霉菌( fusariumfujikuroi)?cctcc?no:m?2019378中發(fā)酵副產(chǎn)物比卡菌素和鐮刀菌素的影響，并增加該菌中赤霉素合成，基于此，得到一株高產(chǎn)赤霉素的基因工程菌株。由本專利技術(shù)提供的上述高產(chǎn)赤霉素的基因工程菌株，赤霉素發(fā)酵生產(chǎn)較出發(fā)菌株提高了30%以上，且產(chǎn)量穩(wěn)定，具有傳代穩(wěn)定性。
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1.一種副產(chǎn)物消除的赤霉素高產(chǎn)菌，其特征在于：由同時敲除比卡菌素基因簇和鐮刀菌素基因簇得到。
2.如權(quán)利要求1所述的一種副產(chǎn)物消除的赤霉素高產(chǎn)菌，其特征在于：底盤菌為藤倉赤霉菌(Fusarium?fujikuroi)?CCTCC?NO:M?2019378。
3.如權(quán)利要求1所述的一種副產(chǎn)物消除的赤霉素高產(chǎn)菌，其特征在于：比卡菌素基因簇的NCBI登陸號為NC_036626.1。
4.如權(quán)利要求1或3所述的一種副產(chǎn)物消除的赤霉素高產(chǎn)菌，其特征在于：鐮刀菌素基因簇的NCBI登陸號為NC_036623.1。
5.如權(quán)利要求1~4任一項所述赤霉素高產(chǎn)菌的構(gòu)建方法，其特征在于：包括以下步驟：
6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于：比卡菌素基因簇敲除框的制備方法為：取bik1基因的供體DNA序列片段、比卡菌素基因簇的上游核苷酸序列片段和比卡菌素基因簇的下游核苷酸序列片段進行融合PCR，其中：
7.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于：鐮刀菌素基因簇敲除框的制備方法包括以下步驟：取fsr1基因的供體DNA序列片段、鐮
8.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于：所述藤倉赤霉菌的保藏編號為CCTCCNO：M?2019378。
9.如權(quán)利要求1~4任一項所述赤霉素高產(chǎn)菌在發(fā)酵生產(chǎn)赤霉素中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種副產(chǎn)物消除的赤霉素高產(chǎn)菌，其特征在于：由同時敲除比卡菌素基因簇和鐮刀菌素基因簇得到。
2.如權(quán)利要求1所述的一種副產(chǎn)物消除的赤霉素高產(chǎn)菌，其特征在于：底盤菌為藤倉赤霉菌(fusarium?fujikuroi)?cctcc?no:m?2019378。
3.如權(quán)利要求1所述的一種副產(chǎn)物消除的赤霉素高產(chǎn)菌，其特征在于：比卡菌素基因簇的ncbi登陸號為nc_036626.1。
4.如權(quán)利要求1或3所述的一種副產(chǎn)物消除的赤霉素高產(chǎn)菌，其特征在于：鐮刀菌素基因簇的ncbi登陸號為nc_036623.1。
5.如權(quán)利要求1~4任一項所述赤霉素高產(chǎn)菌的構(gòu)建方法，其特征在于：包括以下步驟：
<...【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：柳志強，李寧寧，黃良剛，宋伊欣，張博，鄭裕國，
申請(專利權(quán))人：浙江工業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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