【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于測序，涉及一種高通量小體系ngs文庫構建方法。
技術介紹
1、二代測序技術(next-generation?sequencing，ngs)是目前高通量測序技術中最常用的技術，在常規的ngs建庫中，ngs建庫的一般流程：(1)樣本準備：從生物樣本(如血液、組織等)中提取dna或rna；(2)核酸提取：使用適當的方法(如化學法、物理法等)從樣本中分離出dna或rna；(3)文庫構建：1)片段化：將dna或rna樣本剪切成適當長度的短片段；2)末端修復和連接：對dna或rna片段的末端進行修復，并加入適當的鏈接器(一種短dna序列)，將dna片段連接到文庫中；3)擴增和純化：通過pcr等方法擴增文庫中的dna片段數量，并通過純化步驟去除雜質和未連接的dna片段，以提高文庫的質量和純度；(4)文庫質控：對構建好的文庫進行質量控制，以確保其符合測序要求(5)文庫存儲：將合格的文庫存儲在適當的條件下，以待后續測序使用。
2、如cn108866155a公開了一種下一代測序文庫的制備方法，按照如下步驟進行：(1)dna定量：將抽提的基因組dna取2-5μl，測定基因組dna的濃度；(2)在待測dna片段的兩端加上測序時需要的dna接頭序列；(3)dna文庫的濃度和dna片段長度分布模式的檢測；(4)dna文庫混合比例的計算和混合：根據目標片段的濃度，從每個文庫都取相同總量的目標dna進行混合，獲得最終混合的文庫；(5)混合文庫的片段選擇：將混合好的文庫進行片段選擇；(6)被選擇dna文庫的檢測和定量；(7)被選擇dna
3、但是按照現有的建庫方法和流程，文庫構建過程時間長，整體建庫通量較低，且建庫試劑盒成本較高，對建庫人員的技術水平要求高，因此，開發一種高通量、低成本的建庫方法對于二代測序領域具有重要意義。
技術實現思路
1、針對現有技術的不足和實際需求，本專利技術提供一種高通量小體系ngs文庫(包括轉錄組和重測序)構建方法，以期實現快速、高通量、低成本、自動化地進行ngs文庫構建。
2、為達此目的，本專利技術采用以下技術方案：
3、第一方面，本專利技術提供了一種高通量小體系重測序文庫構建方法，所述高通量小體系重測序文庫構建方法包括以下步驟：
4、(1)對dna進行打斷處理，獲得片段化產物；
5、(2)將片段化產物與接頭進行接頭連接，獲得接頭連接產物；
6、(3)對接頭連接產物進行純化處理及片段分選，獲得分選產物；
7、(4)對分選產物進行pcr擴增，獲得擴增產物；
8、(5)對擴增產物產物進行純化處理，得到測序文庫。
9、優選地，步驟(1)中的打斷處理的試劑通過非接觸式分液儀dragonfly分液。
10、優選地，打斷處理包括加熱到35-38℃保持6-30min，使dna被隨機打斷，然后進行63-66℃，25-35min酶失活。
11、優選地，步驟(2)中的接頭通過自動液體處理工作站sciclone-384操控，接頭連接的緩沖液通過非接觸式分液儀dragonfly分液。18-22℃保持12-18min得到連接產物。
12、優選地，步驟(3)中純化處理的純化磁珠及純化后回融的水通過非接觸式分液儀dragonfly操控，純化處理過程中的棄上清及乙醇清洗步驟的通過非接觸式微孔板核酸純化系統g.pure完成，利用自動液體處理工作站sciclone-384進行多孔板之間的液體轉移。
13、本專利技術中，設計全新的文庫構建流程，整合非接觸式分液儀(如dragonfly)、自動液體處理工作站sciclone-384和非接觸式微孔板核酸純化系統g.pure等儀器設備，提高建庫自動化水平，操作通量，可實現384孔板操作，單次建庫384個樣品。dragonfly非接觸式分液儀，能實現高通量準確分液，dragonfly依靠固相置換槍頭，可同時進行多通道非接觸式分液，量程范圍在200nl-4ml，精確度可達納升級，且不受液體黏度或環境條件影響，解決了微縮化體系中加樣體積太少、不精確的問題，極大的節省建庫試劑，使實驗標準化，且加樣快速，一板384孔板加樣僅需幾分鐘，節省了實驗時間。g.pure是德國cytena公司針對下一代測序技術(ngs)工作流程中的dna純化，推出的創新型自動化解決方案，采用非接觸式技術，能夠反向去除384孔板中的液體，有效減少樣本污染，提升數據質量。同時可實現向384孔板中分配乙醇進行漂洗，與傳統的方式相比，節省了大量槍頭，且g.pure上清液棄除干凈，避免了乙醇殘留對后續文庫產量造成的影響。g.pure的整個操作流程僅需幾分鐘的時間，降低了實驗成本和時間。自動液體處理工作站sciclone-384是瑞孚迪(revvity)公司開發的高通量自動化建庫工作站sciclone?g3?ngsx?iq?ht，配備384通道移液頭，內置抓板頭及桌面式inheco?odtc熱循環儀，自動化程度獲得極大提高。
14、優選地，步驟(4)中pcr擴增的酶和引物混合后通過非接觸式分液儀dragonfly分裝到多孔板中，與分選產物混合，進行pcr擴增，pcr擴增程序為：
15、95-98℃，3-5min預變性；
16、95-98℃，10-30s變性，60-65℃，15?-30s退火，70-73℃，30-45s延伸，進行8-10循環擴增；
17、70-73℃延伸3-5min。
18、優選地，步驟(5)中純化處理的純化磁珠及純化后回融的水通過非接觸式分液儀dragonfly操控，純化過程中的棄上清及乙醇清洗步驟的通過非接觸式微孔板核酸純化系統g.pure操控，利用自動液體處理工作站sciclone-384進行多孔板之間的液體轉移。
19、優選地，所述多孔板包括384孔板。
20、優選地，所述高通量小體系測序文庫構建方法中使用的建庫體系為0.1×。
21、本專利技術中，由傳統的1×建庫體系縮減至0.1×，在不降低文庫產量的基礎上，實現試劑用量縮減10倍，極大的降低了單樣本建庫成本。
22、第二方面，本專利技術提供一種高通量小體系轉錄組文庫構建方法，所述高通量小體系轉錄組文庫構建方法包括以下步驟：
23、(s1)對mrna進行富集純化處理；
24、(s2)對純化后mrna進行打斷處理，獲得片段化mrna；
25、(s3)以片段化mrna為模板，反轉錄合成第一鏈cdna；
26、(s4)利用第一鏈cdna合成第二鏈cdna，并進行末端修復和加a；
27、(s5)將雙鏈cdna與接頭進行接頭連接，獲得接頭連接產物；
28、(s6)對接頭連接產物進行純化處理及片段分選，獲得分選產物；
29、(s7)對分選產物進行pcr擴增，獲得擴增產物；
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1.一種高通量小體系重測序文庫構建方法，其特征在于，所述高通量小體系測序文庫構建方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的高通量小體系重測序文庫構建方法，其特征在于，步驟(1)中的打斷處理的試劑通過非接觸式分液儀Dragonfly分液；
3.根據權利要求1或2所述的高通量小體系重測序文庫構建方法，其特征在于，步驟(3)中純化處理的純化磁珠及純化后回融的水通過非接觸式分液儀Dragonfly操控，純化處理過程中的棄上清及乙醇清洗步驟的通過非接觸式微孔板核酸純化系統G.PURE完成，利用自動液體處理工作站Sciclone-384進行多孔板之間的液體轉移；
4.一種高通量小體系轉錄組文庫構建方法，其特征在于，所述高通量小體系轉錄組文庫構建方法包括以下步驟：
5.根據權利要求4所述的高通量小體系轉錄組文庫構建方法，其特征在于，步驟(S2)中打斷處理的試劑通過非接觸式分液儀Dragonfly分液；
6.一種小體系mRNA富集純化方法，其特征在于，所述小體系mRNA富集純化方法應用于權利要求4或5所述的高通量小體系轉錄組文庫構建方
7.根據權利要求6所述的小體系mRNA富集純化方法，其特征在于，步驟(S1-1)中的磁珠通過非接觸式分液儀Dragonfly進行分液；
8.一種片段分選方法，其特征在于，所述片段分選方法應用于權利要求1-3任一項所述的高通量小體系測序文庫構建方法或權利要求4或5所述的高通量小體系轉錄組文庫構建方法中，包括以下步驟：
9.根據權利要求8所述的片段分選方法，其特征在于，步驟(SS-1)中第一DNA純化磁珠的磁珠倍數為0.6-0.7×，用量為6-7μL，步驟(SS-5)中第二DNA純化磁珠的磁珠倍數為0.45-0.6×，用量為4.5-6μL，步驟(SS-7)中第三DNA純化磁珠的磁珠倍數為0.6-0.7×，用量為8.1-10.5μL；
10.根據權利要求8或9所述的片段分選方法，其特征在于，其特征在于，步驟(SS-3)、(SS-4)、(SS-5)、(SS-6)(SS-10)、(SS-11)中的洗脫產物通過自動液體處理工作站Sciclone-384轉移；
...【技術特征摘要】
1.一種高通量小體系重測序文庫構建方法，其特征在于，所述高通量小體系測序文庫構建方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的高通量小體系重測序文庫構建方法，其特征在于，步驟(1)中的打斷處理的試劑通過非接觸式分液儀dragonfly分液；
3.根據權利要求1或2所述的高通量小體系重測序文庫構建方法，其特征在于，步驟(3)中純化處理的純化磁珠及純化后回融的水通過非接觸式分液儀dragonfly操控，純化處理過程中的棄上清及乙醇清洗步驟的通過非接觸式微孔板核酸純化系統g.pure完成，利用自動液體處理工作站sciclone-384進行多孔板之間的液體轉移；
4.一種高通量小體系轉錄組文庫構建方法，其特征在于，所述高通量小體系轉錄組文庫構建方法包括以下步驟：
5.根據權利要求4所述的高通量小體系轉錄組文庫構建方法，其特征在于，步驟(s2)中打斷處理的試劑通過非接觸式分液儀dragonfly分液；
6.一種小體系mrna富集純化方法，其特征在于，所述小體系mrna富集純化方法應用于權利要求4或5所...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張雪川，鄭洪坤，畢經德，陳汝英，
申請(專利權)人：北京百邁客生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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