一種高效生產(chǎn)分支人乳寡糖乳酰-N-新六糖（LNnH）的方法和重組菌株及其應(yīng)用技術(shù)

技術(shù)編號：44487831 閱讀：3 留言：0更新日期：2025-03-04 17:52

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種高效生產(chǎn)分支人乳寡糖乳酰?N?新六糖(lacto?N?neohexaose,LNnH,Galβ1,4GlcNAcβ1,3(Galβ1,4GlcNAcβ1,6)Galβ1,4Glc)的方法和重組菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)提供了LNnH的全細(xì)胞合成方法，其成本低、效率高，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。另外，LNnH作為分支人乳寡糖的核心結(jié)構(gòu)，本發(fā)明專利技術(shù)提供的方法將有利于彌補(bǔ)分支人乳寡糖生物合成技術(shù)的空白，促進(jìn)對分支人乳寡糖的研究和開發(fā)。

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【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生化醫(yī)藥，具體涉及一種高效生產(chǎn)分支人乳寡糖乳酰-n-新六糖(lacto-n-neohexaose,lnnh,galβ1,4glcnacβ1,3(galβ1,4glcnacβ1,6)galβ1,4glc)的方法和重組菌株及其應(yīng)用。

技術(shù)介紹

1、人乳寡糖(human?milk?oligosaccharides,hmos)是母乳中以游離形式存在的一類寡糖，具有多種重要的生理功能，在嬰幼兒生長發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。hmos通過多種機(jī)制促進(jìn)嬰幼兒健康成長，如調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、促進(jìn)益生菌生長、抑制病原體定殖，進(jìn)而降低感染風(fēng)險(xiǎn)并增強(qiáng)免疫力。目前，已鑒定出約200種hmos，部分hmos(例如2’-fl，lnnt，lnt)已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(fda)和歐洲食品安全局(efsa)的批準(zhǔn)，我國也在2023年批準(zhǔn)兩種hmos應(yīng)用于嬰兒配方奶粉。

2、根據(jù)結(jié)構(gòu)特征，hmos可分為線性hmos和分支hmos兩類。對于線性hmos的合成研究相對較為深入，且技術(shù)較為成熟，目前已有化學(xué)法和酶法等合成方法的報(bào)道。相較于結(jié)構(gòu)簡單的線性hmos，分支hmos的合成難度更大，糖鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需要引入β1,6glcnac分支，高效合成方法還存在一定的局限性。王鵬課題組通過化學(xué)法獲得了分支五糖(xiao,z.；guo,y.；liu,y.；li,l.；zhang,q.；wen,l.；wang,x.；kondengaden,s.m.；wu,z.；zhou,j.；cao,x.；li,x.；ma,c.；wang,p.g.,chemoenzymati

3、盡管目前已有化學(xué)法和酶法等方法成功合成分支hmos，但目前關(guān)于分支hmos全細(xì)胞合成的研究仍處于空白階段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)提供一種高效生產(chǎn)分支人乳寡糖乳酰-n-新六糖(lnnh)的方法和重組菌株及其應(yīng)用。

2、在本專利技術(shù)第一方面，提供一種生產(chǎn)分支人乳寡糖乳酰-n-新六糖(lnnh)的重組菌株，其過表達(dá)β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(lgta)、β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(lgtb)、β1,6-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(gcnt2)和udp-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶(gale)，并敲除了編碼β-半乳糖苷酶(lacz)、葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶(nagb)和udp-n-乙酰氨基葡萄糖2-差向異構(gòu)酶(wecb)的基因。

3、在本專利技術(shù)的一些實(shí)施方案中，所述重組菌株為重組大腸桿菌，即其底盤細(xì)胞為escherichia?coli，例如，但不限于，e.coli?origami(de3)、e.coli?origami2(de3)、e.coli?origamib(de3)、e.coli?shuffle?t7的一種及其相關(guān)的改造菌株。

4、在本專利技術(shù)的一些實(shí)施方案中，所述底盤細(xì)胞為e.coli?shuffle?t7。

5、在本專利技術(shù)的一些實(shí)施方案中，所述底盤細(xì)胞為e.coli?origamib(de3)。

6、優(yōu)選地，所述重組菌株中還表達(dá)促溶標(biāo)簽，如硫氧還蛋白a(thioredoxin?a，trxa)、麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose?binding?protein，mbp)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione?s-transferase，gst)、小泛素樣修飾蛋白(small?ubiquitin-relatedmodifier，sumo)、nusa(n-utilization?substance?a)、gb1(b1?domain?of?streptococcalprotein?g)等，特別是mbp。具體地，前述過表達(dá)的蛋白編碼基因中的一種或多種帶有該促溶標(biāo)簽，例如β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(lgta)、編碼β1,6-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(gcnt2)帶有促溶標(biāo)簽(特別是mbp)。

7、在本專利技術(shù)的一些實(shí)施方案中，所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(lgta)的編碼基因(lgta)來源于腦膜炎雙球菌(neisseria?meningitidis)，其核苷酸序列如seq?id?no:61所示。

8、在本專利技術(shù)的一些實(shí)施方案中，所述β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(lgtb)的編碼基因(lgtb)來源于腦膜炎雙球菌，其核苷酸序列如seq?id?no:63所示。

9、在本專利技術(shù)的一些實(shí)施方案中，所述β1,6-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(gcnt本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

1.一種高效生產(chǎn)分支人乳寡糖乳酰-N-新六糖(lacto-N-neohexaose,LNnH,Galβ1,4GlcNAcβ1,3(Galβ1,4GlcNAcβ1,6)Galβ1,4Glc)的重組菌株，其過表達(dá)β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(LgtA)、β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(LgtB)、β1,6-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(GCNT2)和UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶(GalE)，并敲除了編碼β-半乳糖苷酶(lacZ)、葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶(nagB)和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖2-差向異構(gòu)酶(wecB)的基因；

2.如權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于，所述β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(LgtA)的編碼基因(lgtA)如SEQ?ID?NO:61所示；和/或，所述β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(LgtB)的編碼基因(lgtB)如SEQ?ID?NO:63所示；和/或，所述β1,6-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(GCNT2)的編碼基因(gcnt2)如SEQ?ID?NO:64所示；和/或，所述UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶(GalE)的編碼基因(galE)如SEQ?ID?NO:62所示。

3.如權(quán)利要求1或2所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株中還表達(dá)促溶標(biāo)簽；

4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的重組菌株的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：

5.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述雙表達(dá)載體系統(tǒng)由表達(dá)載體Ⅰ、表達(dá)載體Ⅱ組成，表達(dá)載體Ⅰ包含編碼β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(LgtA)的基因lgtA、β1,6-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(GCNT2)的基因gcnt2，表達(dá)載體Ⅱ中包含編碼β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(LgtB)的基因lgtB、編碼UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶(GalE)的基因galE。

6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述表達(dá)載體Ⅰ為質(zhì)粒，選自：pETDuet-1、pCOLADuet-1、pACYCDuet-1；所述表達(dá)載體Ⅱ?yàn)橘|(zhì)粒，選自：pETDuet-1、pCOLADuet-1、pACYCDuet-1；

7.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述表達(dá)載體Ⅰ中還包含促溶標(biāo)簽；

8.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的重組菌株的發(fā)酵方法，其包括：將所述重組菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；

9.一種表達(dá)載體的組合物，其包括表達(dá)載體Ⅰ、表達(dá)載體Ⅱ，其中，表達(dá)載體Ⅰ包含編碼β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(LgtA)的基因lgtA、β1,6-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(GCNT2)的基因gcnt2，表達(dá)載體Ⅱ中包含編碼β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(LgtB)的基因lgtB、編碼UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶(GalE)的基因galE；

10.一種用于構(gòu)建生產(chǎn)分支人乳寡糖LNnH的重組菌株的試劑盒，其包含權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體組合物。

11.一種表達(dá)GCNT2的重組大腸桿菌，其通過將包含GCNT2編碼基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入底盤細(xì)胞得到；

12.一種合成分支人乳寡糖LNnH的方法，其包括將權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的重組菌株進(jìn)行發(fā)酵和誘導(dǎo)培養(yǎng)的步驟或權(quán)利要求8所述的發(fā)酵方法的步驟。

13.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的重組菌株、權(quán)利要求8所述的發(fā)酵方法或權(quán)利要求12所述的方法在制備分支寡糖中的應(yīng)用；

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【技術(shù)特征摘要】

1.一種高效生產(chǎn)分支人乳寡糖乳酰-n-新六糖(lacto-n-neohexaose,lnnh,galβ1,4glcnacβ1,3(galβ1,4glcnacβ1,6)galβ1,4glc)的重組菌株，其過表達(dá)β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(lgta)、β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(lgtb)、β1,6-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(gcnt2)和udp-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶(gale)，并敲除了編碼β-半乳糖苷酶(lacz)、葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶(nagb)和udp-n-乙酰氨基葡萄糖2-差向異構(gòu)酶(wecb)的基因；

2.如權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于，所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(lgta)的編碼基因(lgta)如seq?id?no:61所示；和/或，所述β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(lgtb)的編碼基因(lgtb)如seq?id?no:63所示；和/或，所述β1,6-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(gcnt2)的編碼基因(gcnt2)如seq?id?no:64所示；和/或，所述udp-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶(gale)的編碼基因(gale)如seq?id?no:62所示。

3.如權(quán)利要求1或2所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株中還表達(dá)促溶標(biāo)簽；

4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的重組菌株的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：

5.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述雙表達(dá)載體系統(tǒng)由表達(dá)載體ⅰ、表達(dá)載體ⅱ組成，表達(dá)載體ⅰ包含編碼β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(lgta)的基因lgta、β1,6-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(gcnt2)的基因gcnt2，表達(dá)載體...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：房俊強(qiáng)，李因雙，凌沛學(xué)，李爽，
申請(專利權(quán))人：山東大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：

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