【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于環境污染修復，具體是涉及一種耦聯重金屬感知模塊和好氧硫酸鹽還原模塊實現環境重金屬污染物精確綠色修復的方法，該方法以環境微生物為底盤微生物，利用合成生物學技術耦聯重金屬感知途徑和好氧硫酸鹽還原途徑，實現環境重金屬原位精準修復。
技術介紹
1、重金屬污染會導致土壤結構破壞，生物多樣性下降，土壤微生物活性受抑制，嚴重影響土壤的自凈能力和農作物的質量與產量。因此，控制重金屬離子在環境中的遷移，對維持生態安全和環境健康具有重要意義。
2、現有技術在處理環境重金屬污染方面采取了多種方法，包括物理法、化學法和生物法。物理法主要是通過土壤更換和固化等方式降低重金屬的生物可利用性，但成本較高且引起二次污染。化學法包括使用化學試劑進行沉淀、絡合等。這些方法雖然處理速度快，但往往成本較高、難以持久，且易造成環境二次污染。因此，生物法，特別是微生物修復方法，因其對重金屬的吸收和轉化能力，被認為是一種綠色環保低成本的重金屬污染修復途徑。
3、硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing?bacteria，srb)是一類能夠利用硫酸根作為電子受體，進行硫酸鹽呼吸的厭氧細菌。srb能在土壤、海水、河水地下管道以及油氣井、淹水稻田土壤、河流和湖泊沉積物、沼泥等富含有機質和硫酸鹽的厭氧生境中廣泛分布。之前的研究主要發現srb通過異化硫酸鹽還原途徑產生的s2-能夠將重金屬鈍化為不溶性的金屬硫化物，從而降低重金屬的環境遷移。然而，srb是專性厭氧菌，其生長條件需要嚴格的厭氧環境，在實際環境中的應用場景受限較大。s2-也可以通過
4、為了實現環境重金屬的綠色低碳修復，利用微生物產生s2-將重金屬轉化為不溶性的金屬硫化物是一條重要途徑。因此，利用合成生物學策略開發新型硫酸鹽還原微生物，實現有氧條件下硫酸鹽還原的可控高效進行，將對我國環境重金屬的原位生物修復和綠色治理具有重要的應用價值。
技術實現思路
1、針對當前硫酸鹽還原菌進行環境重金屬污染修復的瓶頸問題，本專利技術基于合成生物學策略，通過基因工程技術引入兩種獨特的酶，構建了一條好氧硫酸鹽還原途徑：(1)對半胱氨酸負反饋抑制不敏感的絲氨酸乙酰轉移酶(cyse768)，引導硫酸鹽還原生成過量半胱氨酸；(2)編碼半胱氨酸脫硫酶(cdsh)的cdsh，將過量的半胱氨酸轉化為s2-。同時，通過引入重金屬感知模塊，來控制好氧硫酸鹽還原過程，從而構建“感控一體”遺傳模塊，并將其轉化到環境微生物中，構建出新型的重金屬修復工程菌株。該工程菌株在感知到重金屬存在時，能夠直接利用環境中的硫酸鹽作為硫源，通過有氧還原途徑產生s2-，將重金屬離子轉化為不溶性的金屬硫化物，從而實現重金屬污染的綠色低碳修復。
2、為了實現上述目的，本專利技術所采用的技術方案為：
3、一種耦聯重金屬感知模塊和好氧硫酸鹽還原模塊實現環境重金屬污染物精確綠色修復的方法，通過合成生物學策略，將重金屬感知模塊和好氧硫酸鹽還原模塊相互耦聯，構建重金屬“感控一體”模塊，并用其改造環境微生物，構建重金屬修復工程菌株；該工程菌株能夠根據環境重金屬污染類型來特異性開啟好氧硫酸鹽還原模塊的表達，從而將重金屬離子轉化為穩定的金屬硫化物，實現環境重金屬污染物的原位綠色低碳修復。步驟如下：
4、(1)通過基因編輯手段，將不受半胱氨酸負反饋抑制影響的cyse768蛋白與能夠將半胱氨酸轉化為h2s的cdsh蛋白結合，構建好氧硫酸鹽還原模塊；
5、(2)將不同類型的重金屬感應蛋白基因及其相應的誘導型啟動子分別插入重組質粒，構建重金屬感知模塊，實現對不同環境重金屬污染物的響應；
6、(3)將構建的重金屬感知模塊和好氧硫酸鹽還原模塊耦聯成“感控一體”修復模塊，并將其導入到環境微生物中，構建新型的硫酸鹽還原工程菌株；
7、(4)利用該工程菌株，在有氧條件下可控高效生成s2-，從而將重金屬污染物轉化為不溶性金屬硫化物，實現重金屬的精確感知與精準修復。
8、本專利技術的具體步驟為：
9、(1)從e.coli基因組中對cyse基因進行克隆，構建穿梭質粒pbf-cyse；設計引物對cyse基因進行突變，將位于768bp處的堿基g突變為a，構建穿梭質粒pbf-cyse768；合成cdsh基因，將其整合到穿梭質粒pbf-cyse768，構建重組質粒pbf-plac-cdsh-cyse768，并去除cdsh基因的內源性啟動子gspa，得到同化硫酸鹽還原模塊；通過電穿孔和接合轉移的方法將重組質粒導入e.coli?dh5α或s.oneidensis?mr-1中進行功能驗證。
10、(2)合成或擴增不同來源的重金屬感知蛋白基因及相應的誘導型啟動子，構建重組質粒pbf-plac-x-px-egfp，得到重金屬感知模塊；其中x表示不同類型的重金屬感知蛋白基因，px表示受重金屬感知蛋白調控的誘導型啟動子；通過電穿孔和接合轉移的方法將重組質粒導入e.coli?dh5α，利用綠色熒光信號進行感知蛋白特異性和靈敏度檢測。
11、本專利技術構建的重金屬感知模塊能夠特異性響應環境重金屬鎘、銅、鉛、砷以及汞。
12、(3)利用同源重組的方法，將構建的重金屬感知模塊和好氧硫酸鹽還原模塊耦聯成“感控一體”修復模塊；通過電穿孔和接合轉移的方法將重組質粒導入e.coli?dh5α或s.oneidensis?mr-1中，對整合后的修復模塊進行驗證；成功驗證后，通過crispr基因編輯技術將其轉移到環境微生物中，構建新型的硫酸鹽還原工程菌株。
13、(4)利用新型的硫酸鹽還原工程菌株，在有氧條件下可控高效生成s2-，從而將重金屬污染物轉化為不溶性金屬硫化物，并對重金屬離子的去除效果進行檢測。本專利技術構建的該工程菌株能用于土壤重金屬、水體重金屬、以及工業重金屬廢水等低成本修復。
14、本專利技術所述模板菌株e.coli?mg1655購自美國大腸桿菌菌種保藏中心，保藏編號為cgsc?6300。
15、本專利技術所述底盤微生物之一為具有好氧同化硫酸鹽還原途徑的革蘭氏陰性菌e.coli?dh5α，其購自美國典型培養物保藏中心，菌株編號為atcc?pta-1798。
16、本專利技術所述底盤微生物之一為具有好氧同化硫酸鹽還原途徑的革蘭氏陰性菌s.oneidensis?mr-1，其購自美國典型培養物保藏中心，菌株編號為atcc?700550tm。
17、本專利技術的cyse本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種耦聯重金屬感知模塊和好氧硫酸鹽還原模塊實現環境重金屬污染物精確綠色修復的方法，其特征在于，通過合成生物學策略，將重金屬感知模塊和好氧硫酸鹽還原模塊相互耦聯，構建重金屬“感控一體”模塊，并用其改造環境微生物，構建重金屬修復工程菌株；該工程菌株能夠根據環境重金屬污染類型來特異性開啟好氧硫酸鹽還原模塊的表達，從而將重金屬離子轉化為穩定的金屬硫化物，實現環境重金屬污染物的原位綠色低碳修復。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，具體步驟如下：
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述好氧硫酸鹽還原模塊的遺傳構建方法為：從E.coli基因組中對cysE基因進行克隆，構建穿梭質粒pBF-cysE；設計引物對cysE基因進行突變，將位于768bp處的堿基G突變為A，構建穿梭質粒pBF-cysE768；合成cdsH基因，將其整合到穿梭質粒pBF-cysE768，構建重組質粒pBF-Plac-cdsH-cysE768，并去除cdsH基因的內源性啟動子gspA，得到同化硫酸鹽還原模塊；通過電穿孔和接合轉移的方法將重組質粒導入E.coli?DH5α或S.oneid
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述重金屬感知模塊的遺傳構建方法為：合成或擴增不同來源的重金屬感知蛋白基因及相應的誘導型啟動子，構建重組質粒pBF-Plac-X-PX-egfp，得到重金屬感知模塊；其中X表示不同類型的重金屬感知蛋白基因，PX表示受重金屬感知蛋白調控的誘導型啟動子；通過電穿孔和接合轉移的方法將重組質粒導入E.coliDH5α，利用綠色熒光信號進行感知蛋白特異性和靈敏度檢測。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，構建的重金屬感知模塊能夠特異性響應環境重金屬鎘、銅、鉛、砷以及汞。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述重金屬“感控一體”模塊的遺傳構建方法為：利用同源重組的方法，將構建的重金屬感知模塊和好氧硫酸鹽還原模塊耦聯成“感控一體”修復模塊；通過電穿孔和接合轉移的方法將重組質粒導入E.coli?DH5α或S.oneidensisMR-1中，對整合后的修復模塊進行驗證；成功驗證后，通過CRISPR基因編輯技術將其轉移到環境微生物中，構建新型的硫酸鹽還原工程菌株。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述重金屬修復工程菌株的構建方法為：利用新型的硫酸鹽還原工程菌株，在有氧條件下可控高效生成S2-，從而將重金屬污染物轉化為不溶性金屬硫化物，并對重金屬離子的去除效果進行檢測。
8.如權利要求1-7任一項所述方法構建的重金屬修復工程菌株。
9.如權利要求8所述的重金屬修復工程菌株應用于土壤重金屬、水體重金屬、以及工業重金屬廢水修復。
...【技術特征摘要】
1.一種耦聯重金屬感知模塊和好氧硫酸鹽還原模塊實現環境重金屬污染物精確綠色修復的方法，其特征在于，通過合成生物學策略，將重金屬感知模塊和好氧硫酸鹽還原模塊相互耦聯，構建重金屬“感控一體”模塊，并用其改造環境微生物，構建重金屬修復工程菌株；該工程菌株能夠根據環境重金屬污染類型來特異性開啟好氧硫酸鹽還原模塊的表達，從而將重金屬離子轉化為穩定的金屬硫化物，實現環境重金屬污染物的原位綠色低碳修復。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，具體步驟如下：
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述好氧硫酸鹽還原模塊的遺傳構建方法為：從e.coli基因組中對cyse基因進行克隆，構建穿梭質粒pbf-cyse；設計引物對cyse基因進行突變，將位于768bp處的堿基g突變為a，構建穿梭質粒pbf-cyse768；合成cdsh基因，將其整合到穿梭質粒pbf-cyse768，構建重組質粒pbf-plac-cdsh-cyse768，并去除cdsh基因的內源性啟動子gspa，得到同化硫酸鹽還原模塊；通過電穿孔和接合轉移的方法將重組質粒導入e.coli?dh5α或s.oneidensis?mr-1中進行功能驗證。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述重金屬感知模塊的遺傳構建方法為：合成或擴增不同來源的重金屬感知蛋白基因及相應的誘導型啟動子，構建重組質粒...
【專利技術屬性】
技術研發人員：肖翔，吳坤，柴雨涵，范陽陽，胡雅新，黃婷，劉璇，
申請(專利權)人：安徽大學，
類型：發明
國別省市：
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