【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程領域，具體涉及基于引導編輯系統實現基因組大片段倒位編輯的方法。
技術介紹
1、農藝性狀的改良依賴于植物的遺傳變異，包括單核苷酸多態性(snps)和大的結構變異，比如大的缺失、倒位等等。這些變異在基因組進化和植物農藝性狀的遺傳控制中起著關鍵作用。雖然目前基于crispr/cas的基因組編輯技術(如crispr/cas核酸酶、堿基編輯器和引導編輯器)的效率和精度在植物基因組編輯方面已經有了很大的提高，但這些技術在很大程度上仍然局限于進行小的改變，例如引入小的缺失或插入或堿基替換。更大的dna序列的操縱，如kb及mb級的片段倒位，仍然是一個巨大的挑戰。
2、crispr/cas核酸酶，如cas9，在目標dna中誘導雙鏈斷裂(dsbs)，與成對的向導rna(grnas)可以誘導基因組結構變異，包括植物的大的染色體片段缺失、倒位等。然而，這種方法主要產生小片段插入或者刪除(indels)，更復雜的結構變異的頻率要低得多，并且經常引入許多不希望的結果，例如由于dsbs的存在而導致的隨機小片段插入或刪除(indels)或更復雜的染色體重排。
3、引導編輯系統prime?editing是一種基于crispr/cas技術的可以精確修改靶位點序列的系統，由cas9核酸酶(cas9-h840a)和逆轉錄酶(rt,reverse?transcriptase)構成的融合蛋白及3’端帶有rt模板(rt?template)和游離單鏈的結合區(pbs,primer?bindingsite)的pegrna組成。該系統
4、引導編輯(prime?editor，pe)系統是美國broad研究所劉如謙(david?r.liu)團隊開發的一種基因編輯方法，這種方法可以在不引入雙鏈斷裂(dsb)和供體dna模板的前提下，實現靶標位點的插入，缺失和所有12種類型點突變。
5、引導編輯(prime?editing)是一種基于“搜索和替換”(search-and-replace)的基因組編輯方式。引導編輯的搜索功能是基于改造的向導rna(the?engineered?guide?rna，the?pegrna)，pegrna中包含基因編輯中的single?guide?rnas(sgrnas)，不同的是，在其3′-端還有一段引物結合序列(primer?binding?site，pbs)和轉錄模板序列(rt?template,rtt)。prime?editor蛋白由cas9切口酶(cas9?nickase即dead?cas9，僅有切割單鏈的功能，h840a)和逆轉錄酶(m-mlv?rt)融合而成。
6、而當使用兩個pegrna時，通過設計兩個pegrna的序列，可操縱植物基因組產生大片段變異，這樣在修復過程中避免了誘導產生雙鏈斷裂，具有更高的安全性和精準性。
7、盡管基因組編輯工具箱在哺乳動物細胞中迅速擴展，但仍然缺乏能夠有效和精確地設計植物中大型基因組結構變異的基因組編輯工具。引導編輯系統能夠不產生dsb而借助細胞修復途徑產生染色體片段實現植物大片段的精準刪除、替換及倒位，是一種實現植物大片段dna操縱的有效途徑。
技術實現思路
1、本專利技術所要解決的技術問題是如何對單子葉和雙子葉植物實現dna(大)片段倒位編輯和/或如何用引導編輯系統高效地對單子葉和/或雙子葉植物實現dna(大)片段倒位編輯操縱。
2、為了解決上述技術問題，本專利技術首先提供了使生物基因組中dna片段發生倒位的方法，所述方法可包括：
3、a1)提供待編輯生物的待倒位區段，所述待倒位區段是所述待編輯生物的基因組dna中的一條雙鏈dna片段，該雙鏈dna片段由名稱為a鏈和名稱為b鏈的兩條互補的單鏈dna以雙螺旋的方式互補結合而成，所述a鏈的方向為從左末端到右末端是5′到3′，所述b鏈的方向為從右末端到左末端是5′到3′，所述待倒位區段的兩末端分別稱為左末端和右末端，所述左末端位于a鏈的5′端，所述右末端位于a鏈的3′端，所述左末端和所述右末端均含有pam，所述左末端中的pam的名稱為pama，所述pama位于a鏈上但不位于b鏈上，所述右末端中的pam的名稱為pamb,所述pamb位于b鏈上但不位于a鏈上，所述pam是核苷酸序列是5′-ngg-3′的單鏈dna片段；所述n為脫氧核糖核苷酸a、g、c或t；
4、a2)提供名稱為pegl和pegr的兩種pegrna，所述pegl含名稱為rna左末端的rtt-l，所述pegr含名稱為rna右末端的rtt-r，所述rna左末端的rtt-l核苷酸序列與右末端的所述a鏈的核苷酸序列相同，所述rna右末端的rtt-r核苷酸序列與左末端的所述b鏈的核苷酸序列相同；
5、a3)提供prime?editor蛋白，所述prime?editor蛋白是具有逆轉錄酶活性和對雙鏈dna造成缺刻(nick)活性的蛋白質；
6、a4)使所述兩種pegrna和所述prime?editor蛋白與待編輯生物的基因組dna接觸，實現將所述待編輯生物的基因組中所述待倒位區段進行倒位。
7、上述方法中，所述左末端和/或所述右末端的長度可等于所述rtt-l和/或所述rtt-r的長度。
8、上述方法中，所述倒位(inversion)是指染色體片段中prime?editor蛋白造成的兩個缺刻(nick)中間的片段倒轉180°的現象。所述dna片段的長度可為700bp-252kb。
9、所述rtt的長度可為18-50nt，如30nt。
10、上述方法中，所述生物可為植物；所述植物可為單子葉植物和/或雙子葉植物。
11、所述單子葉植物可為小麥；所述雙子葉植物可為煙草或番茄。
12、為了解決上述技術問題，本專利技術還提供了dna，所述dna可為下述至少一種：
13、b1)兩種pegrna基因，所述兩種pegrna基因為能轉錄出上文所述的pegl和pegr的dna，
14、b2)用于使生物基因組中dna片段發生倒位的dna，所述dna含有上文所述的primeeditor蛋白的編碼基因和b1)所述兩種pegrna基因，
15、b3)含有b1)所述dna的重組載體，
16、b4)含有b2)所述dna的重組載體。
17、上述dna中，所述生物可為植物；所述植物可為單子葉植物和/或雙子葉植物。
18、所述單子葉植物可為小麥；所述雙子葉植物可為煙草或番茄。
19、為了解決上述技術問題，本專利技術還提供了含有上文所述dna的重組微生物在制備使生物基因組中dna片段發生倒位的產品中的應用。
20、所述產品可為試劑或試劑盒。
21、上述應用本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.使生物基因組中DNA片段發生倒位的方法，其特征在于：所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述左末端和/或所述右末端的長度等于所述RTT-L和/或所述RTT-R的長度。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述生物為植物；所述植物為單子葉植物和/或雙子葉植物。
4.DNA，其特征在于：所述DNA為下述至少一種：
5.根據權利要求4所述的DNA，其特征在于：所述生物為植物；所述植物為單子葉植物和/或雙子葉植物。
6.含有權利要求4或5所述DNA的重組微生物在制備使生物基因組中DNA片段發生倒位的產品中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于：所述生物為植物；所述植物為單子葉植物和/或雙子葉植物。
8.組合物，其特征在于：所述組合物含有權利要求1中所述兩種pegRNA和權利要求1中所述prime?editor蛋白。
9.根據權利要求8所述的組合物，其特征在于：所述prime?editor蛋白的編碼序列為序列表中序列1或序列1的第628-6810位
...【技術特征摘要】
1.使生物基因組中dna片段發生倒位的方法，其特征在于：所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述左末端和/或所述右末端的長度等于所述rtt-l和/或所述rtt-r的長度。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述生物為植物；所述植物為單子葉植物和/或雙子葉植物。
4.dna，其特征在于：所述dna為下述至少一種：
5.根據權利要求4所述的dna，其特征在于：所述生物為植物；所述植物為單子葉植物和/或雙子葉植物。
...【專利技術屬性】
技術研發人員：宗媛，王延鵬，孫其信，倪中福，趙一迪，
申請(專利權)人：中國農業大學，
類型：發明
國別省市：
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