【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種重組軟骨素6-o-磺基轉移酶突變體及其在合成硫酸軟骨素c中的應用，屬于生物工程。
技術介紹
1、硫酸軟骨素c(chondroitin?sulfate?c，csc)的結構特征在于n-乙酰半乳糖胺的c-6羥基被拔質子并進行了磺酸基團修飾，其二糖單元由glcaβ1-3galnac(6s)所組成。硫酸軟骨素c在血管疾病方面，表現出抗動脈粥樣硬化、抗凝血、抗血栓形成等特性；在神經發育方面，cs在神經信號轉導過程中起主要作用，能夠改善中樞神經系統的活動，有利于大腦的發育；在骨關節炎方面，可以作為軟骨修復和再生的重要分子，還能夠充當抗氧化劑和抗炎藥物。
2、目前合成csc的途徑有三種：組織提取、化學合成和生物合成。(1)組織提取是當前工廠生產csc的主要策略。工業上通常以動物組織為原料來提取csc，該過程涉及一系列復雜且冗長的步驟，存在步驟繁瑣、能耗高以及易引入病毒等缺陷。(2)化學合成存在csc鏈長有限、分子量低：hsieh-wilson等人報道了csc四糖的合成方法，但此方法存在步驟復雜和條件苛刻的問題。(3)生物合成法的關鍵限制因素在于酶活低：康振等人在畢赤酵母gs115重組菌中表達軟骨素6-o-磺基轉移酶，利用分泌至培養基中的磺基轉移酶催化生成csc，以軟骨素為底物時的酶活為0.20±0.01u/mg。但是軟骨素6-o-磺基轉移酶天然活性低，限制了生物法合成csc的發展，仍然需要開發新的方法以提高軟骨素6-o-磺基轉移酶的磺酸化效率。
技術實現思路
1、本專
2、在一種實施方式中，所述突變體是將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的第143位、第173位、第209位、第210位、第310位的氨基酸中的一個或多個進行突變得到的。
3、在本專利技術的一種實施方式中，所述突變體為以下(a)～(e)任一：
4、(a)將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的軟骨素6-o-磺基轉移酶rnchst3的第210位的苯丙氨酸突變為精氨酸，得到seq?id?no.2所示的突變體命名為m1；
5、(b)將氨基酸序列如seq?id?no.2所示的軟骨素6-o-磺基轉移酶rnchst3的第310位的酪氨酸突變為苯丙氨酸，得到seq?id?no.3所示的突變體命名為m2；
6、(c)將氨基酸序列如seq?id?no.3所示的軟骨素6-o-磺基轉移酶rnchst3的第209位的丙氨酸突變為亮氨酸，得到seq?id?no.4所示的突變體命名為m3；
7、(d)將氨基酸序列如seq?id?no.4所示的軟骨素6-o-磺基轉移酶rnchst3的第303位的丙氨酸突變為絲氨酸，得到seq?id?no.5所示的突變體命名為m4；
8、(e)將氨基酸序列如seq?id?no.5所示的軟骨素6-o-磺基轉移酶rnchst3的第173位的異亮氨酸突變為亮氨酸，得到seq?id?no.6所示的突變體命名為m5。
9、在一種實施方式中，所述重組軟骨素6-o-磺基轉移酶突變體的氨基酸序列如seqid?no.1～6任一所示。
10、本專利技術還提供了一種編碼上述重組軟骨素6-o-磺基轉移酶突變體的基因。
11、本專利技術還提供了攜帶上述基因的重組載體。
12、在一種實施方式中，所述重組載體以pet-28a為表達載體。
13、本專利技術還提供了攜帶上述基因，或上述重組載體的微生物細胞。
14、在一種實施方式中，所述微生物細胞以原核或真核為表達宿主。
15、在一種實施方式中，所述微生物細胞以escherichia?coli?rosetta(de3)為表達宿主。
16、本專利技術還提供了一種重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌表達了上述重組軟骨素6-o-磺基轉移酶突變體。
17、在一種實施方式中，所述重組大腸桿菌以escherichia?coli?rosetta(de3)為表達宿主，以pet-28a為表達載體。
18、本專利技術還提供了一種獲得上述重組軟骨素6-o-磺基轉移酶rnchst3突變體的方法，所述方法包括以下步驟：
19、(1)在重組軟骨素6-o-磺基轉移酶rnchst3氨基酸序列的基礎上確定突變位點；設計突變引物，以攜帶重組軟骨素6-o-磺基轉移酶rnchst3基因的載體為模板進行突變；構建位點突變的質粒載體；
20、(2)將位點突變的質粒載體轉化進宿主細胞；
21、(3)挑選陽性克隆進行發酵培養，并純化軟骨素6-o-磺基轉移酶rnchst3。
22、在一種實施方式中，所述宿主細胞為大腸桿菌。
23、本專利技術還提供所述重組大腸桿菌或所述方法在生產硫酸軟骨素或含硫酸軟骨素的產品中的應用。
24、本專利技術還提供了一種csc的制備方法，所述方法為：將上述重組軟骨素6-o-磺基轉移酶rnchst3突變體，或上述微生物細胞，或上述重組大腸桿菌的粗酶或純酶添加至含有軟骨素和3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸的反應體系中，進行反應制備得到。
25、在一種實施方式中，所述軟骨素在反應體系中的終濃度為：5～20g/l。
26、在一種實施方式中，所述3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸在反應體系中的終濃度為：5.1～20.4g/l。
27、在一種實施方式中，反應條件為：在ph?6.5～8.5、35～40℃條件下反應24～48h。
28、本專利技術還提供了上述重組軟骨素6-o-磺基轉移酶rnchst3突變體，或上述基因，或上述重組載體，或上述重組細胞，或上述重組大腸桿菌在制備csc的產品中的應用。
29、有益效果：
30、(1)本專利技術提供了一種重組軟骨素6-o-磺基轉移酶rnchst3及其突變體，用于催化生產硫酸軟骨素c。
31、(2)本專利技術重組軟骨素6-o-磺基轉移酶rnchst3突變體對軟骨素6-o磺酸化為硫酸軟骨素c的轉化率，相對于重組軟骨素6-o-磺基轉移酶rnchst3提高了3倍。在37℃、ph?7.5的條件下反應24h，磺酸化率達到46％。采用本專利技術的方法，提高了單位催化劑的生產能力和催化劑的反應效率，降低了反應的成本，加快了酶轉化法生產硫酸軟骨素c的工業化進程。
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1.軟骨素6-O-磺基轉移酶突變體，其特征在于，將SEQ?ID?NO.1所示重組軟骨素6-O-磺基轉移酶的第210位、第310位、第209位、第143位、第173位的氨基酸中的一個或多個進行突變得到的。
2.根據權利要求1所述的軟骨素6-O-磺基轉移酶突變體，其特征在于，具有(a)～(e)任一突變：
3.編碼權利要求1或2所述軟骨素6-O-磺基轉移酶突變體的基因。
4.攜帶權利要求3所述基因的重組載體。
5.攜帶權利要求3所述基因，或權利要求4所述的重組載體的微生物細胞。
6.重組大腸桿菌，其特征在于，表達了權利要求1或2所述的軟骨素6-O-磺基轉移酶突變體。
7.根據權利要求6所述的重組大腸桿菌，其特征在于，以Escherichia?coli?Rosetta(DE3)為表達宿主，以pET-28a為表達載體。
8.一種制備硫酸軟骨素C的方法，其特征在于，將權利要求1或2所述的軟骨素6-O-磺基轉移酶突變體，或權利要求5所述的微生物細胞，或權利要求6或7所述的重組大腸桿菌添加至含有軟骨素和3’-磷酸
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，在pH?6.5～8.5、35～40℃反應24～48h。
10.權利要求1或2所述的軟骨素6-O-磺基轉移酶突變體，或權利要求3所述的基因，或權利要求4所述的重組載體，或權利要求5所述的微生物細胞，或權利要求6～7任一所述的重組大腸桿菌，或權利要求8～9任一所述方法在制備硫酸軟骨素C或含硫酸軟骨素C的產品中的應用。
...【技術特征摘要】
1.軟骨素6-o-磺基轉移酶突變體，其特征在于，將seq?id?no.1所示重組軟骨素6-o-磺基轉移酶的第210位、第310位、第209位、第143位、第173位的氨基酸中的一個或多個進行突變得到的。
2.根據權利要求1所述的軟骨素6-o-磺基轉移酶突變體，其特征在于，具有(a)～(e)任一突變：
3.編碼權利要求1或2所述軟骨素6-o-磺基轉移酶突變體的基因。
4.攜帶權利要求3所述基因的重組載體。
5.攜帶權利要求3所述基因，或權利要求4所述的重組載體的微生物細胞。
6.重組大腸桿菌，其特征在于，表達了權利要求1或2所述的軟骨素6-o-磺基轉移酶突變體。
7.根據權利要求6所述的重組大腸桿菌，其特征在于，以escherich...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉立明，孟偉偉，魏婉清，宋偉，李曉敏，胡貴鵬，高聰，聞建，劉佳，溫碧瑩，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
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