【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及食品加工，特別涉及一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽及其制備方法。
技術介紹
1、骨質疏松病是一種全身性骨骼代謝疾病，并且是全球范圍內影響人健康的常見疾病之一。據統計，每年有150多萬人死于骨質疏松病。骨質疏松病主要表現為骨結構惡化、骨密度降低、骨骼脆性增加和骨折風險增加。一些維生素d、雌激素替代藥、鈣鹽、雙磷酸鹽和降鈣素等藥物常用于治療骨質疏松病。雖然這些藥物在改善骨密度、減少骨丟失、降低骨折發生等方面具有積極作用，但是，長期服用會增加患子宮內膜癌和乳腺癌風險，也會導致心血管和消化道疾病等。因此，開發新型有益于骨健康、無副作用的膳食營養補充劑(包括活性肽)，成為食品領域的熱點問題。
2、天然蛋白質及其衍生物(活性肽)對骨健康有多種益處，能夠維持骨的形成和重塑，促進骨關節組織恢復，預防骨質疏松病。例如，奶酪的體外胃腸道消化物能夠促進腸道鈣吸收和saos-2細胞外骨基質的形成。耗牛骨膠原肽對去卵巢大鼠的骨質疏松具有緩解作用。羅非魚和太平洋鱈魚膠原蛋白均具有良好的生物相容性和細胞相容性，能夠通過加快細胞周期循環促進纖維細胞和成骨細胞的增殖，維持骨平衡，促進骨再生，鱈魚骨膠原肽通過增加成骨細胞的骨密度，有效的防止骨量丟失，緩解骨質疏松的形成。眾所周知，肽類物質通過插入大的疏水側鏈、d-氨基酸取代、甲基化、縮醛、酰胺化、環化、聚合及交聯等化學修飾進一步改造肽結構，從而改變肽序列、營養組成及生物活性。例如，豬血漿蛋白水解物通過氧化丹寧酸或綠原酸修飾，具有更高的抗氧化活性。由胃酶和胰酶水解鮭魚肌原纖維蛋白制備的水解物
3、目前，還尚未有使用特定的方法對鮭魚皮明膠水解物、木瓜蛋白酶通過類蛋白反應化學修飾而獲得促成骨作用的鮭魚皮明膠類蛋白修飾食用肽的報道，尤其沒有關于使用特定甘氨酸組成及配比來進一步協同改善成骨作用的類蛋白修飾食用肽的報道。因此，開發、制備一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽，有望成為骨關節組織恢復的潛在口服補充劑，應用于骨健康類保健食品加工領域。
技術實現思路
1、鑒于此，本專利技術的目的在于提出一種具有工藝簡單、易于操作、周期短、無需復雜設備、明顯提高促成骨作用的鮭魚皮明膠類蛋白修飾食用肽制備方法，可以拓寬鮭魚皮明膠水解物的利用率，提高產品的成骨活性。
2、本專利技術提供的一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽及其制備方法，解決目前國內外可食性生物活性肽在骨健康類營養保健食品研究領域制備的活性肽促成骨作用不明顯，最終導致無法批量生產促成骨作用的營養可食肽，限制了生物活性肽應用于功能性食品加工行業，特別是限制了骨健康類營養保健食品加工的問題。
3、本專利技術的技術方案是這樣實現的：
4、一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽的制備方法，包括如下步驟：
5、s1：稱取鮭魚皮明膠，用去離子水配制成鮭魚皮明膠溶液，取鮭魚皮明膠溶液，加入木瓜蛋白酶，調節溶液ph，以55～65℃進行酶解7～9h，滅酶后，離心，收集上清液，進行冷凍干燥，得鮭魚皮明膠水解物；木瓜蛋白酶的酶解適宜溫度為55～65℃，在其他溫度條件下水解效果欠佳，且木瓜蛋白酶相比于其他酶，其用于水解鮭魚皮得到的鮭魚皮明膠水解物進行后續的類蛋白反應，效率有所提高。
6、s2：將鮭魚皮明膠水解物配制成高濃度的水解液，添加甘氨酸甲酯鹽酸鹽，攪拌，添加特定活力木瓜蛋白酶，調節溶液ph，以35～40℃進行酶解反應5～7h，滅酶后，終止反應，得類蛋白修飾肽溶液；所述甘氨酸甲酯鹽酸鹽的添加量按照游離氨基含量與總游離氨基含量比至少為0.4mol/mol進行添加；
7、s3：將類蛋白修飾肽溶液進行冷凍干燥后，鼓風干燥至恒重，得所述促成骨作用的類蛋白修飾食用肽。
8、本專利技術鮭魚皮明膠、甘氨酸與木瓜蛋白酶之間發生類蛋白反應需要四步過程：第一步，水解反應。木瓜蛋白酶在最適ph值條件下，催化低濃度的鮭魚皮明膠肽鏈在不同地方斷裂，水解成小分子肽段。木瓜蛋白酶與鮭魚皮明膠結合時形成?；钢虚g產物，中間物與水作用時導致鮭魚皮明膠水解成小分子肽段，所得水解物的平均相對分子質量下降，自由端基含量相應上升，游離氨基含量增加。同時，在木瓜蛋白酶的作用下，水解反應會使水解鮭魚皮明膠內部的疏水基團暴露。第二步，縮合反應。高鮭魚皮明膠水解物濃度與木瓜蛋白酶形成?；钢虚g物，促進水解肽的氨基酸與氨基酸之間發生縮合反應形成新的肽鍵，導入新的基團，實現蛋白質的改性。其中，木瓜蛋白酶的存在是類蛋白反應的物質基礎，因為只有形成酰化酶中間物才能促進新的肽鍵的生成。第三步，轉肽作用。?；钢虚g物與高濃度的鮭魚皮明膠水解物、甘氨酸甲酯鹽酸鹽這些親核試劑反應時，就會使得反應向類蛋白合成方向進行，其自由端基含量不變化。在蛋白酶轉肽作用過程中，能夠將鮭魚皮明膠水解的小肽轉變成高分子量的肽，肽鏈增長，形成高摩爾分子的類蛋白物。同時，還促進甘氨酸甲酯鹽酸鹽進行酰胺基的轉移，將甘氨酸導入到鮭魚皮明膠水解肽段上，從而改造水解肽結構，影響其理化性質、生物活性及功能性質。第四步，疏水相互作用(物理聚合作用)。鮭魚皮明膠是一種膠原蛋白的衍生物，具有獨特的氨基酸組成特征，即富含甘氨酸(摩爾比約1/3)、脯氨酸(摩爾比接近10％)、羥脯氨酸(非膠原蛋白質含量極低)，雖然鮭魚皮明膠是親水性膠體，但隨著類蛋白反應的進行，在木瓜蛋白酶作用下，鮭魚皮明膠水解多肽鏈內部的疏水面暴露，使得水解多肽鏈間發生疏水相互作用形成聚合物，同時，甘氨酸為非極性、疏水性氨基酸，疏水性較強的甘氨酸甲酯鹽酸鹽的存在，誘使更多的疏水性氨基酸暴露，使得疏水性甘氨基酸得以富集到肽鏈母體上，形成疏水相互作用，引起類蛋白物疏水性指數上升，更有利于類蛋白反應的發生。因此，疏水相互作用是形成類蛋白物的主要作用力，類蛋白物的形成存在一種分子重排的過程，通過非共價鍵作用物理聚集成膠裝物質沉淀出來，類蛋白物的形成也促進多肽向聚合的正反應方向進行，從而維系類蛋白反應產物的結構。
9、類蛋白反應中新的肽鍵的形成存在轉肽作用機制。鮭魚皮明膠、木瓜蛋白酶與甘氨酸甲酯鹽酸鹽之間發生水解與合成反應作用機理如下：
10、
11、同時，本專利技術創造性選用木瓜蛋白酶存在條件下甘氨酸介導鮭魚皮明膠水解物發生類蛋白反應。甘氨酸甲酯鹽酸鹽游離氨基含量與總游離氨基含量的比例分別為0.4mol/mol、0.6mol/mol和0.8mol/mol，三者不同比例甘氨酸介導的類蛋白修飾肽，取得預料不到的技術效果。發生類蛋白反應過程中導入不同比例的甘氨酸，使得鮭魚皮明膠水解物在木瓜蛋白酶催化作用下，發生轉肽數量與轉肽作用位點不同，導致肽鏈的序列、排布和空間結構不同，形成不同理化性質與生物活性的類蛋白修本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1的一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽的制備方法，其特征在于，所述甘氨酸甲酯鹽酸鹽的添加量按照游離氨基含量與總游離氨基含量比為0.6～0.8mol/mol進行添加。
3.根據權利要求1的一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽的制備方法，其特征在于，步驟S1中，所述鮭魚皮明膠溶液的質量濃度為3～7g/100mL；步驟S2中，所述高濃度水解液的質量濃度為30～50g/100mL。
4.根據權利要求1的一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽的制備方法，其特征在于，步驟S1和S2中，所述滅酶的溫度為85～95℃，滅酶的時間為10～20min。
5.根據權利要求1所述的一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽及其制備方法，其特征在于，步驟S1中，添加木瓜蛋白酶的活力為3.5kU/g蛋白質，調節體系pH值為7.0，水浴溫度為60℃，水解時間為8h。
6.根據權利要求1所述的一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽及其制備方法，其特征在于，步驟S2中，木瓜蛋白酶添加量為3.
7.根據權利要求1的一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽的制備方法，其特征在于，步驟S1和S3中，所述冷凍干燥包括真空冷凍干燥，所述真空冷凍干燥的真空度為0.01～0.5mbar，真空冷凍干燥的冷阱溫度為-72℃～-45℃，真空冷凍干燥的時間為48h。
8.一種根據權利要求1～7任意一項的一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽的制備方法制備得到的類蛋白修飾食用肽。
9.一種根據權利要求8所述的類蛋白修飾食用肽，其特征在于，所述類蛋白修飾食用肽可直接溶于水，具有骨骼保健作用，可作為骨關節組織恢復的潛在口服補充劑，應用于保健食品加工領域。
...【技術特征摘要】
1.一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1的一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽的制備方法，其特征在于，所述甘氨酸甲酯鹽酸鹽的添加量按照游離氨基含量與總游離氨基含量比為0.6～0.8mol/mol進行添加。
3.根據權利要求1的一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽的制備方法，其特征在于，步驟s1中，所述鮭魚皮明膠溶液的質量濃度為3～7g/100ml；步驟s2中，所述高濃度水解液的質量濃度為30～50g/100ml。
4.根據權利要求1的一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽的制備方法，其特征在于，步驟s1和s2中，所述滅酶的溫度為85～95℃，滅酶的時間為10～20min。
5.根據權利要求1所述的一種促成骨作用的類蛋白修飾食用肽及其制備方法，其特征在于，步驟s1中，添加木瓜蛋白酶的活力為3.5ku/g蛋白質，調節體系ph值...
【專利技術屬性】
技術研發人員：石云嬌，張強，邰怡菘，張璇，賀貞云，
申請(專利權)人：海南經貿職業技術學院，
類型：發明
國別省市：
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