【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于干細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種治療炎癥的干細(xì)胞生物活性納米囊泡。
技術(shù)介紹
1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal?stem?cells，mscs)是一種來(lái)源于組織中胚層間質(zhì)的、具有多向分化及自我更新潛能的成體干細(xì)胞，它具有典型的三系分化潛能。近年來(lái)研究證實(shí)，臍帶來(lái)源的mscs具有免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥、促進(jìn)血管再生重建、異體移植無(wú)排斥反應(yīng)等作用，因此被廣泛應(yīng)用于多種疾病的臨床前研究或臨床研究。然而作為一種細(xì)胞治療手段，mscs經(jīng)皮下或靜脈移植后，其粒徑大且具有一定免疫原性，因此很難發(fā)揮出色的歸巢和治療效果。另外，mscs制劑的保存和運(yùn)輸過(guò)程較為復(fù)雜，從細(xì)胞培養(yǎng)到臨床應(yīng)用過(guò)程中干細(xì)胞的活性下降顯著。更重要的是，干細(xì)胞在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)具有潛在致瘤風(fēng)險(xiǎn)，這些都極大限制了干細(xì)胞的產(chǎn)品開發(fā)及應(yīng)用。
2、近年來(lái)，隨著人們對(duì)分子生物學(xué)及細(xì)胞治療的深入研究，mscs來(lái)源的細(xì)胞外囊泡(extracellular?vesicles，evs)因其具有多種治療優(yōu)勢(shì)而得到人們的廣泛關(guān)注。mscs-evs是由mscs自發(fā)分泌的具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡，根據(jù)大小和釋放方式，可將其大致分為三種亞型：外泌體(30-150nm)、微囊泡(100-1000nm)和凋亡小體(1-5μm)。mscs-evs本身不具備自我復(fù)制能力，從根本上規(guī)避了直接移植mscs可能引起的致瘤風(fēng)險(xiǎn)。其次，mscs-evs可以在-80℃條件下長(zhǎng)期存儲(chǔ)或在4℃條件下短期存儲(chǔ)，亦可制成凍干品在室溫長(zhǎng)期保存，極大地降低了其臨床應(yīng)用的難度。此外，evs可以有效解決mscs可能引發(fā)的免疫原性問(wèn)
3、外泌體(exosomes，exo)是目前最受關(guān)注的一類evs，其直徑介于30-150nm之間，其在電鏡下呈圓形杯托狀的磷脂囊泡。作為干細(xì)胞旁分泌信號(hào)的載體，exo可以向靶細(xì)胞傳遞蛋白質(zhì)、mrnas、micrornas和其他信號(hào)分子，通過(guò)調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路參與炎癥調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖與遷移、血管新生、ecm重塑和抑制瘢痕形成等過(guò)程，從而在多種疾病的治療中表現(xiàn)出大潛能。盡管干細(xì)胞外泌體在多種損傷類型疾病修復(fù)方面顯示出潛在的應(yīng)用前景，但其在臨床應(yīng)用中仍面臨若干關(guān)鍵技術(shù)挑戰(zhàn)。首先，外泌體的提取方法較為復(fù)雜，常見(jiàn)技術(shù)如超速離心、超濾和免疫親和分離等不僅操作繁瑣，而且成本高昂。此外，外泌體的提取效率普遍偏低，難以大量獲得滿足臨床需求的外泌體。更重要的是，干細(xì)胞外泌體在自然狀態(tài)下通常缺乏對(duì)特定的炎癥組織或損傷細(xì)胞的靶向性，一定程度上亦限制了其組織器官修復(fù)再生能力。
4、干細(xì)胞凋亡小體(apoptotic?bodies，abs)亦是近年來(lái)被廣泛關(guān)注的evs，它是一種在細(xì)胞發(fā)生凋亡的過(guò)程中產(chǎn)生的特殊evs，其粒徑在1μm以上，包含了豐富的生物分子，如dna、rna、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，其展現(xiàn)出在介導(dǎo)細(xì)胞間通訊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)交流、組織發(fā)育再生以及疾病發(fā)生和治療中的潛在作用。此外，abs表面具備典型外翻的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，ps)分子，發(fā)出“噬我”信號(hào)，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的快速募集、高效吞噬，從而發(fā)揮強(qiáng)效的炎癥靶向及調(diào)節(jié)作用。已有研究表明，干細(xì)胞凋亡小體在損傷修復(fù)類型疾病中具備較大的應(yīng)用價(jià)值。盡管abs具備強(qiáng)大的組織修復(fù)及炎癥調(diào)節(jié)能力，但由于目前abs的制備方法是對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)，其自發(fā)產(chǎn)生的abs粒徑分布極不均一，且粒徑分布跨度較大(1-5μm)，這些因素一方面導(dǎo)致制備過(guò)程難以自控，生產(chǎn)批次間差異較大，難以建立統(tǒng)一的質(zhì)量控制及給藥標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化應(yīng)用；另一方面，由于abs較大的粒徑分布，其靜脈注射后極易引起致死性肺血栓栓塞，而局部使用時(shí)其對(duì)組織器官的穿透能力亦受限于其較大的粒徑。
5、由此可見(jiàn)，目前亟待開發(fā)一種制備工藝簡(jiǎn)單、質(zhì)量可控且同時(shí)具有更強(qiáng)修復(fù)及靶向功能的干細(xì)胞生物活性納米囊泡，以解決干細(xì)胞囊泡制劑臨床轉(zhuǎn)化難度高的問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、鑒于上述的技術(shù)缺陷，即外泌體提取方案復(fù)雜繁瑣、提取效率低效、特異性靶向作用差；凋亡小體粒徑較大、分布極不均一且制備過(guò)程難以自控等問(wèn)題，本專利技術(shù)的目的在于提供了一種可以程序化制備、易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)且同時(shí)具備更強(qiáng)修復(fù)和炎癥靶向功能的干細(xì)胞生物活性納米囊泡(mesenchymal?stem?cell?nanovesicles，msc-nvs)及其制備方法和應(yīng)用。
2、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)的第一方面提供了一種具有高效炎癥調(diào)節(jié)及組織修復(fù)作用的干細(xì)胞生物活性納米囊泡，所述納米囊泡的平均粒徑為100-350nm，多分散系數(shù)(pdi)為0.05-0.40，所述納米囊泡表面的磷脂酰絲氨酸(ps)表達(dá)率大于40％。
3、優(yōu)選的，所述納米囊泡的平均粒徑為150-300nm。更優(yōu)選的，所述納米囊泡的平均粒徑為150-250nm。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述納米囊泡的平均粒徑為150-200nm。
4、優(yōu)選的，所述納米囊泡的多分散系數(shù)(pdi)為0.05-0.30。更優(yōu)選的，所述納米囊泡的多分散系數(shù)(pdi)為0.05-0.25。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述納米囊泡的多分散系數(shù)(pdi)為0.05-0.20。
5、優(yōu)選的，所述納米囊泡表面的磷脂酰絲氨酸(ps)表達(dá)率大于45％。更優(yōu)選的，所述納米囊泡表面的磷脂酰絲氨酸(ps)表達(dá)率大于50％。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述納米囊泡表面的磷脂酰絲氨酸(ps)表達(dá)率大于55％。
6、優(yōu)選的，所述納米囊泡可通過(guò)0.22μm濾膜實(shí)現(xiàn)終端滅菌。
7、優(yōu)選的，所述納米囊泡的形貌為類圓形，具備細(xì)胞膜狀結(jié)構(gòu)。
8、優(yōu)選的，所述納米囊泡具有比干細(xì)胞外泌體和干細(xì)胞凋亡小體更為強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)能力。
9、優(yōu)選的，所述納米囊泡是通過(guò)先將干細(xì)胞進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)，再采用程序性串聯(lián)擠出工藝制備得到的。
10、優(yōu)選的，所述凋亡誘導(dǎo)的方法為化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)、物理方法誘導(dǎo)或者基因調(diào)控誘導(dǎo)。
11、優(yōu)選的，所述凋亡誘導(dǎo)的方法為雙氧水誘導(dǎo)、星形孢菌素誘導(dǎo)或者紫外線照射誘導(dǎo)。更優(yōu)選的，所述凋亡誘導(dǎo)的方法為2mm雙氧水誘導(dǎo)3小時(shí)，或者2μm星形孢菌素誘導(dǎo)12小時(shí)，或者照射強(qiáng)度100mj/cm2的紫外線照射誘導(dǎo)20min。
12、優(yōu)選的，所述程序性串聯(lián)擠出工藝如下：在0.1-3.0mpa壓力下，使用串聯(lián)擠出設(shè)備依次通過(guò)孔徑在1μm-10μm之間的大孔徑多孔膜和孔徑在0.1μm-0.7μm之間的小孔徑多孔膜。更優(yōu)選的，所述程序性串聯(lián)擠出工藝如下：在0.5-2.0mpa壓力下，使用串聯(lián)擠出設(shè)備依次通過(guò)孔徑在2μm-5μm之間的大孔徑多孔膜和孔徑在0.2μm-0.5μm之間的小孔徑多孔膜。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述程序性串聯(lián)擠出工藝如下：在0.5-1.0mpa壓力下，使用串聯(lián)擠出設(shè)備依次通過(guò)孔徑為5μm的大孔徑多孔膜和孔徑為0.4μm的小孔徑多孔膜。最優(yōu)選的，所述程序性串聯(lián)擠出工藝如下：在本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種具有高效炎癥調(diào)節(jié)及組織修復(fù)作用的干細(xì)胞生物活性納米囊泡，所述納米囊泡的平均粒徑為100-350nm，多分散系數(shù)(PDI)為0.05-0.40，所述納米囊泡表面的磷脂酰絲氨酸(PS)表達(dá)率大于40％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述納米囊泡，其特征在于，所述納米囊泡的形貌為類圓形，具備細(xì)胞膜狀結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述納米囊泡，其特征在于，所述納米囊泡是通過(guò)先將干細(xì)胞進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)，再采用程序性串聯(lián)擠出工藝制備得到的。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述納米囊泡的制備方法，其特征在于，所述制備方法包含以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的納米囊泡的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的干細(xì)胞包括但不限于未經(jīng)改造的干細(xì)胞或者經(jīng)過(guò)物理、化學(xué)、生物方法改造的干細(xì)胞，所述干細(xì)胞的種類包括但不限于臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、經(jīng)血來(lái)源的干細(xì)胞、臍帶血來(lái)源的干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、子宮內(nèi)膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的納米囊泡的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的程序性串聯(lián)擠出工藝方法如下：收集凋亡細(xì)胞，使用串聯(lián)擠出設(shè)備，在一定壓力下，按照孔徑由大到小的順序依次通過(guò)多層多孔膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的納米囊泡的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中串聯(lián)擠出依次通過(guò)大孔徑多孔膜和小孔徑多孔膜，所述大孔徑多孔膜的孔徑在1μm-10μm之間，小孔徑多孔膜的孔徑在0.1μm-0.7μm之間。
9.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的干細(xì)胞生物活性納米囊泡在制備預(yù)防或治療疾病的藥物中的用途，所述疾病包括遺傳病、癌癥、免疫性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、炎癥性疾病、心血管疾病或感染性疾病。
10.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的干細(xì)胞生物活性納米囊泡在制備醫(yī)美產(chǎn)品中的用途，所述醫(yī)美產(chǎn)品具有選自生發(fā)、美白、除皺、緊致、祛斑、改善黑眼圈、改善紅血絲中的一種或多種功效。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種具有高效炎癥調(diào)節(jié)及組織修復(fù)作用的干細(xì)胞生物活性納米囊泡，所述納米囊泡的平均粒徑為100-350nm，多分散系數(shù)(pdi)為0.05-0.40，所述納米囊泡表面的磷脂酰絲氨酸(ps)表達(dá)率大于40％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述納米囊泡，其特征在于，所述納米囊泡的形貌為類圓形，具備細(xì)胞膜狀結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述納米囊泡，其特征在于，所述納米囊泡是通過(guò)先將干細(xì)胞進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)，再采用程序性串聯(lián)擠出工藝制備得到的。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述納米囊泡的制備方法，其特征在于，所述制備方法包含以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的納米囊泡的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的干細(xì)胞包括但不限于未經(jīng)改造的干細(xì)胞或者經(jīng)過(guò)物理、化學(xué)、生物方法改造的干細(xì)胞，所述干細(xì)胞的種類包括但不限于臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、經(jīng)血來(lái)源的干細(xì)胞、臍帶血來(lái)源的干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、子宮內(nèi)膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。<...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：霍美蓉，廉云飛，郭豪，李健，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南京賽立康生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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