【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及一種利用穩定劑提高低濃度dna儲存穩定性的方法。
技術介紹
1、核酸檢測是一種在醫學、生物學、環境及食品領域被廣泛應用的技術手段，然而某些特殊樣本可獲得的核酸量通常較低，此外，在對目標核酸進行定量檢測或對檢測流程進行質控時需要用到核酸標準品，核酸標準品的穩定性對于檢測結果的可靠性和準確性至關重要，因此，保持核酸(特別是低濃度核酸)在短期和長期儲存過程中的穩定性是核酸檢測領域迫切需要解決的問題。相較于dna，rna分子由于堿基對含量低、易受核酸酶降解、糖基易被氧化和脫水等因素使得rna更加不穩定，因此，通常在rna溶液中添加rnase抑制劑、螯合劑、還原劑、ph緩沖液等以提高rna的儲存穩定性。影響dna儲存穩定性的因素主要包括溫度、管壁吸附、dna長度、緩沖液成分等。對于低濃度、短片段dna，管壁吸附不僅會導致dna濃度降低，還會使dna發生變性，而核酸檢測通常用到的一類標準品即為濃度較低的人工合成dna片段。堿性環境(如te緩沖液)和低溫(如-20℃或-80℃)可以在一定程度上提高dna儲存穩定性。
2、steve?smith等的研究表明在低濃度的dna樣本中添加海藻糖并在-80℃儲存可以提高dna的儲存穩定性，但在儲存12個月后仍檢測到有dna降解，且該研究未檢測在儲存過程中經歷凍融是否會進一步加速dna降解，因此該方法不適用于對穩定性有嚴格要求的dna標準品的儲存；此外，為防止管壁吸附，通常需要在儲存液中添加運載dna/rna(carrierdna/rna)，然而，在dna儲存液中添
3、有鑒于此，本專利技術提供了一種利用穩定劑提高低濃度dna儲存穩定性的方法，可以適用于不同的檢測需求，降低了樣本儲存/制備成本，提高了樣本利用率，為核酸檢測領域提供了新思路與新方法。
技術實現思路
1、為了彌補現有技術的不足，本專利技術的目的在于提供一種利用穩定劑提高低濃度dna儲存穩定性的方法。
2、為了實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、本專利技術第一方面提供了一種提高dna儲存穩定性的穩定劑，所述穩定劑包括與檢測靶標無同源性的rna。
4、進一步，所述與檢測靶標無同源性的rna的制備方法為：以alu序列為輸入，設計與檢測靶標無同源性的dna序列，以crispr系統中的sgrna骨架序列做為固定序列，將sgrna中的可變序列替換為所述與檢測靶標無同源性的dna序列，以含有t7啟動子序列的引物擴增制備體外轉錄模板，所述體外轉錄模板轉錄獲得與檢測靶標無同源性的rna。
5、alu序列是哺乳動物基因組中廣泛分布的重復元件，在人類基因組中約有50萬份拷貝。這種dna序列中包含限制性內切核酸酶alui的識別序列agct，因此被稱為alu重復序列。典型的人基因組alu序列長282bp，由兩個同源但有差別的亞基構成。亞基來源于有缺失突變和點突變的7slrna基因。兩個亞基間由腺嘌呤核苷酸密集的序列連接。右邊的亞基中有無關的31bp插入片段，稱為ih。alu序列兩端各有一個正向重復序列，末端有一個poly(a)尾。研究發現，alu序列在增強子和啟動子rna之間起到中介作用，通過堿基配對形成rna雙鏈，決定增強子-啟動子的配對選擇特異性。
6、本文所用，術語“sgrna”通常是指可以結合cas蛋白并幫助將cas蛋白靶向靶多核苷酸(例如dna或rna)內的特定位置的rna序列或分子(或一組rna分子的集合)。向導rna可以包含crrna區段和tracrrna區段。術語“crrna”或“crrna區段”是指rna分子或其部分，其包括靶向多核苷酸的向導序列、莖序列以及任選地5'突出端序列。術語“tracrrna”或“tracrrna區段”在下文進一步定義，是指包括蛋白質結合區段(例如，蛋白質結合區段能夠與crispr相關蛋白(例如cas9)相互作用)的rna分子或其部分。術語“向導rna”還涵蓋單向導rna(sgrna)，其中crrna片段和tracrrna片段位于同一rna分子中。術語“向導rna”也共同包括兩個或更多個rna分子的組，其中crrna區段和tracrrna區段位于分開的rna分子中。完整的sgrna包含用戶自定義的靶向序列crrna序列(crispr-derived?rna)和通用的cas9核酸酶招募序列tracrrna(trans-activating?rna)，即sgrna＝crrna+tracrrna。crrna序列是根據靶標基因特定位點自定義設計的，是與靶標位點同源的20個核苷酸序列，靶向不同的靶標基因則可設計不同的自定義crrna序列。
7、在本專利技術中，術語“dna”和“rna”旨在包括任何長度的核苷酸的聚合形式，其含有脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其類似物，其包括dna、rna和dna/rna雜合物，其還包括dna或rna類似物，諸如含有修飾的骨架(例如肽核酸(pna)或硫代磷酸酯)或修飾的堿基的那些。因此，本專利技術的dna和rna包括原核生物、真核生物、病毒、類病毒和核酸分子文庫中的dna、cdna、mrna、重組核酸等。
8、在本專利技術中，術語“同源性”又稱“同一性”，是指序列與本專利技術所述的檢測靶標序列至少60％相同、至少65％相同、至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同或100％相同的核苷酸序列。為了確定序列同源性，可通過本領域技術人員了解的各種方式進行序列比對，例如，使用blast、blast-2、align、needle、megalign(dnastar)、snapgene或dnaman軟件等。本領域技術人員能夠確定用于比對的適當參數，包括在所比較的全長序列中實現最優比對所需要的任何算法。
9、進一步，所述與檢測靶標無同源性的rna的濃度為20ng/μl～100ng/μl。
10、進一步，所述與檢測靶標無同源性的rna的濃度為50ng/μl。
11、進一步，所述與檢測靶標無同源性的dna序列長度為20bp。
12、進一步，所述檢測靶標的來源包括原核生物、真核生物、病毒、類病毒和核酸分子文庫中的一種或多種。
13、進一步，所述檢測靶標濃度大于等于0.005pg/μl。
14、進一步，所述穩定劑還包括緩沖液。
15、在本專利技術中，術語“緩沖液”是指用于維持實驗體系正常、穩定ph值的緩沖系統，通常指對實驗中主要體系或后本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種提高DNA儲存穩定性的穩定劑，其特征在于，所述穩定劑包括與檢測靶標無同源性的RNA。
2.根據權利要求1所述的穩定劑，其特征在于，所述與檢測靶標無同源性的RNA的制備方法為：以Alu序列為輸入，設計與檢測靶標無同源性的DNA序列，以CRISPR系統中的sgRNA骨架序列做為固定序列，將sgRNA中的可變序列替換為所述與檢測靶標無同源性的DNA序列，以含有T7啟動子序列的引物擴增制備體外轉錄模板，所述體外轉錄模板轉錄獲得與檢測靶標無同源性的RNA；
3.根據權利要求2所述的穩定劑，其特征在于，所述與檢測靶標無同源性的DNA序列長度為20bp。
4.根據權利要求1所述的穩定劑，其特征在于，所述檢測靶標的來源包括原核生物、真核生物、病毒、類病毒和核酸分子文庫中的一種或多種；
5.根據權利要求1所述的穩定劑，其特征在于，所述穩定劑還包括緩沖液；
6.一種提高低濃度DNA儲存穩定性的方法，其特征在于，所述方法的步驟包括：使用權利要求1-5任一項所述的穩定劑。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述低濃度
8.一種提高低濃度DNA儲存穩定性的產品，其特征在于，所述產品包括權利要求1-5任一項所述的穩定劑；
9.權利要求1-5任一項所述的穩定劑的應用，其特征在于，所述應用包括如下任一項：
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述低濃度DNA的來源包括原核生物、真核生物、病毒、類病毒和核酸分子文庫中的一種或多種；
...【技術特征摘要】
1.一種提高dna儲存穩定性的穩定劑，其特征在于，所述穩定劑包括與檢測靶標無同源性的rna。
2.根據權利要求1所述的穩定劑，其特征在于，所述與檢測靶標無同源性的rna的制備方法為：以alu序列為輸入，設計與檢測靶標無同源性的dna序列，以crispr系統中的sgrna骨架序列做為固定序列，將sgrna中的可變序列替換為所述與檢測靶標無同源性的dna序列，以含有t7啟動子序列的引物擴增制備體外轉錄模板，所述體外轉錄模板轉錄獲得與檢測靶標無同源性的rna；
3.根據權利要求2所述的穩定劑，其特征在于，所述與檢測靶標無同源性的dna序列長度為20bp。
4.根據權利要求1所述的穩定劑，其特征在于，所述檢測靶標的來源包括原核生物、真核生物、病毒、類病毒和核酸分子文庫中的一種或...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張曉麗，鄧濤，侯婉如，秦子婷，劉建紅，曹學敏，孫立超，
申請(專利權)人：北京博奧醫學檢驗所有限公司，
類型：發明
國別省市：
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