【技術實現步驟摘要】
本申請涉及基因工程領域，更具體地說，它涉及一種gpx4?s131a突變型內皮細胞系的構建方法及應用。
技術介紹
1、急性心肌梗死是危害人類健康的重大疾病之一，造成全球經濟負擔。急性心肌梗死的診治涉及冠心病的介入診治、長期藥物治療、康復訓練等綜合管理治療措施。然而急性心肌梗死的發病機理仍未完全闡述。心肌梗死除誘發心肌細胞死亡外，還有導致內皮細胞程序性死亡，包括鐵死亡。內皮細胞鐵死亡的發生會導致心肌血管密度降低，心肌灌注減少，白蛋白滲出增加，進而加劇心肌梗死。因此，抑制內皮細胞鐵死亡，在預防和治療心肌再灌注損傷中至關重要，但目前對內皮細胞鐵死亡的研究機制較少，缺乏有力的研究模型。
2、gpx4(glutathione?peroxidase?4)是哺乳動物體內已知的8種谷胱甘肽過氧化物酶之一，gpx4是gpx異構體中唯一能夠減少酯化氧化脂肪酸和膽固醇氫過氧化物的酶。gpx4可以使得脂質過氧化的過氧鍵轉變為羥基，失去其過氧化物的活性。gpx4通過將gsh轉化為gssh以減輕細胞脂質過氧損傷。基于gpx4的工作原理，目前抑制gpx4活性的主要靶標為促進gsh耗竭，包括：半胱氨酸消耗、system?xc-體系、谷氨酸-半胱氨酸連接酶、谷胱甘肽轉移酶等等。除影響gsh外，gpx4在s131位點的磷酸化也參與了鐵死亡的發生。敲除gpx4或gpx4s131位點突變均可導致鐵死亡的發生。
3、crispr(clustered,regμlarly?interspaced,short?palindromic?repeats)是自
4、因此，若能利用crispr技術實現gpx4的穩定突變，將有助于進一步研究gpx4和內皮細胞鐵死亡之間分子機制，為治療由內皮細胞鐵死亡所致的心血管疾病提供有用的線索。
技術實現思路
1、本專利技術旨在利用crispr/cas9技術構建包含靶向gpx4的grna載體，利用ssodn對gpx4第131位堿基的絲氨酸(s)進行靶向丙氨酸(a)突變，并構建穩定的gpx4s131a突變型內皮細胞鐵死亡模型。
2、第一方面，本申請公開了一種靶向gpx4的sgrna，包括：
3、如seq?id?no:2(cacgcccgatacgctgagtg)所示的sgrna1；
4、如seq?id?no:3(tgagtgtggtttgcggatcc)所示的sgrna2；
5、如seq?id?no:4(gagctgagtgtagtttactt)所示的sgrna3。
6、第二方面，本申請公開了一種grna重組質粒的構建方法，包括以下步驟：
7、s1，合成第一方面所述的sgrna的dna序列及互補序列，并退火成雙鏈dna；
8、s2，酶切及回收sgrna載體gm-24668；
9、s3，第一方面所述的sgrna的dna序列及互補序列與sgrna載體gm-24668連接，轉化，測序。
10、進一步地，步驟s1中，所述sgrna的dna序列及互補序列包括：
11、sgrna1的dna序列seq?id?no:7(caccgcacgcccgatacgctgagtg)及互補序列seq?idno:8(aaaccactcagcgtatcgggcgtgc)；
12、sgrna2的dna序列seq?id?no:9(caccgtgagtgtggtttgcggatcc)及互補序列seq?idno:10(aaacggatccgcaaaccacactcac)；
13、sgrna3的dna序列seq?id?no:11(caccgagctgagtgtagtttactt)及互補序列seq?idno:12(aaacaagtaaactacactcagctc)。
14、第三方面，本申請公開了由第二方面所述的構建方法構建獲得的grna重組質粒。
15、第四方面，本申請公開了由第三方面所述的grna重組質粒在制備gpx4?s131a突變型內皮細胞系中的應用。
16、第五方面，本申請公開了gpx4?s131a突變型內皮細胞系的構建方法，包括以下步驟：
17、s1，使用第三方面所述的grna重組質粒對hcmec細胞進行轉染；
18、s2，使用cas9表達慢病毒感染hcmec細胞；
19、s3，使用抗生素blasticidin對陽性細胞進行篩選，得到cas9穩轉細胞株；
20、s4，在篩選出的cas9穩轉細胞株中加入gpx4?grna病毒及s131assodn，感染；
21、所述ssodn的序列如seq?id?no:13所示；
22、cgggctacaacgtcaaattcgatatgttcgacaagatctgcgtgaacgggga?cgacgcccacccgctgtggaagtggatgaagatccaac(seq?id?no:13)；
23、s5，使用抗生素puro對陽性細胞進行篩選，得到gpx4?s131穩轉細胞株；
24、s6，對gpx4?s131穩轉細胞株進行單克隆處理，測序，得到gpx4?s131突變型內皮細胞系。
25、第六方面，本申請公開了用于構建gpx4?s131突變型內皮細胞系的ssodn，所述ssodn的序列如seq?id?no:13所示。
26、cgggctacaacgtcaaattcgatatgttcgacaagatctgcgtgaacgggga?cgacgcccacccgctgtggaagtggatgaagatccaac(seq?id?no:13)。
27、第七方面，本申請公開了由第五方面所述的構建方法構建得到的gpx4?s131突變型內皮細胞系。
28、第八方面，本申請公開了第七方面所述的gpx4?s131突變型內皮細胞系在基因編輯中的應用。
29、第九方面，本申請公開了一種鐵死亡敏感模型，所述鐵死亡敏感模型為使用鐵死亡誘導劑對第七方面所述的gpx4?s131突變型內皮細胞系進行篩選而得到的對鐵死亡敏感的gpx4?s131突變型內皮細胞系。
30、綜上所述，與現有技術相比，本專利技術具有以下至少一種有益效果：
31、1、所利用的cr本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種靶向GPX4的sgRNA，其特征在于，包括：
2.gRNA重組質粒的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟S1中，所述sgRNA的DNA序列及互補序列包括：
4.權利要求2或3所述的構建方法構建獲得的gRNA重組質粒。
5.權利要求4所述的gRNA重組質粒在制備GPX4?S131A突變型內皮細胞系中的應用。
6.GPX4?S131A突變型內皮細胞系的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.用于構建GPX4?S131A突變型內皮細胞系的ssODN，其特征在于，所述ssODN的序列如SEQ?ID?NO:13所示。
8.權利要求6所述的構建方法構建得到的GPX4?S131A突變型內皮細胞系。
9.權利要求8所述的GPX4?S131A突變型內皮細胞系在基因編輯中的應用。
10.鐵死亡敏感模型，其特征在于，所述鐵死亡敏感模型為使用鐵死亡誘導劑對權利要求8所述的GPX4?S131A突變型內皮細胞系進行篩選而得到的對鐵死亡敏感的
...【技術特征摘要】
1.一種靶向gpx4的sgrna，其特征在于，包括：
2.grna重組質粒的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟s1中，所述sgrna的dna序列及互補序列包括：
4.權利要求2或3所述的構建方法構建獲得的grna重組質粒。
5.權利要求4所述的grna重組質粒在制備gpx4?s131a突變型內皮細胞系中的應用。
6.gpx4?s131a突變型內皮細胞系的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
<...【專利技術屬性】
技術研發人員：劉牧吟，李蘇，錢菊英，陳章煒，殷銘，朱文濤，
申請(專利權)人：復旦大學附屬中山醫院，
類型：發明
國別省市：
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