【技術實現步驟摘要】
本專利技術專利屬于生物，具體涉及乳腺癌類器官的培養基及培養方法。
技術介紹
1、類器官是在三維培養基礎上建立的臨床前模型，用患者來源的正常組織或腫瘤組織進行體外三維培養形成的微型器官，其高度還原且保持原腫瘤組織的生物學特性、病理特征及藥物反應性，極大地滿足了當下精準醫療的需要，雖然乳腺癌類器官模型出現較早、研究較為成熟，但乳腺癌分子分型比較多，對于適合乳腺癌類器官生長的培養基的探索卻從未停止。現有乳腺癌類器官培養基存在以下問題：
2、1、從乳腺癌類腫瘤中取到的腫瘤細胞在乳腺癌類器官培養基中生長較為緩慢，細胞增殖慢，在7~14天內類器官平均直徑小于100μm，不利于后續藥篩實驗；
3、2、類器官能夠運用于精準醫療的主要原因是高度還原原腫瘤組織的生物學特性和病理特征，但現有的類器官培養基卻并不能很好的保持原有組織的病理特征。
4、因此，本文提出了一種乳腺癌類器官的培養基及培養方法。
技術實現思路
1、為了解決上述問題，本專利技術提供一種能夠更快的獲取到大量具有高保真的乳腺癌類器官的乳腺癌類器官的培養基及培養方法。
2、為了達到上述技術效果，本專利技術提供了乳腺癌類器官的培養基，包括advanceddmem/f12基礎培養基、添加劑；
3、所述的添加劑包括青鏈霉素/兩性霉素b、b-27?添加劑、l-谷氨胺酰胺、hepes、n-acetylcysteine、nicotinamide、sb202190、a83-01、fgf10、eg
4、根據本專利技術優選的，所述的添加劑的組分終濃度包括0.5-1.5x的青鏈霉素/兩性霉素b、0.5-1.5x的b-27?添加劑、0.5-1.5x的l-谷氨胺酰胺、9-12mm的hepes、1-1.5mm的n-acetylcysteine、4-6mm的nicotinamide、450-550nm的sb202190、450-550nm的a83-01、45-55ng/ml的fgf10、4-6ng/ml的egf、4-6nm的human?heregulinβ-1、9-12um的y27632、0.4-0.6ug/ml的wnt-3a、0.4-0.6ug/ml的r-spondin?1、0.05-0.12ug/ml的noggin、18-22ng/ml的fgf7、180-220nm的β-estradiol。
5、根據本專利技術優選的，所述的添加劑的組分終濃度包括1x的青鏈霉素，兩性霉素b、1x的b-27?添加劑、1x的l-谷氨胺酰胺、10mm的hepes、1.25mm的n-acetylcysteine、5mm的nicotinamide、500nm的sb202190、500nm的a83-01、50ng/ml的fgf10、5ng/ml的egf、5nm的human?heregulinβ-1、10um的y27632、0.5ug/ml的wnt-3a、0.5ug/ml的r-spondin?1、0.1ug/ml的noggin、20ng/ml的fgf7、200nm的β-estradiol。
6、本專利技術還提供了乳腺癌類器官的培養方法，包括使用本專利技術所述的乳腺癌類器官培養基，所述方法具體包括以下步驟：
7、s1、組織樣本的取材：用取樣工具準確采集乳腺癌腫瘤組織，且需要是腫瘤細胞比較集中、細胞活力好的部位，接著將取出的腫瘤組織塊快速放入預冷的含保存液的離心管中，并運輸至實驗室；
8、進一步地，所述s1中的取材方法具體包括以下步驟：
9、s101、提前準備好織保存運輸液，及在離心管加入保存液，放入運輸箱中，運輸箱溫度4~8℃，放到手術室中；
10、s102、用取樣工具準確采集乳腺癌腫瘤組織，且腫瘤細胞比較集中、細胞活力好的部位，每份腫瘤組織塊紅豆粒大小，不宜過大，取2~3塊組織樣品即可；
11、s103、取出的腫瘤組織塊快速放入預冷的含保存液的離心管中，并放入運輸箱中，此過程控制1min以內；
12、s104、確保樣本被組織保存運輸液完全覆蓋且組織樣品到達實驗室仍處于低溫環境且浸泡在組織保存液中，整個運輸過程控制在2~8℃的低溫環境中，運輸時間小于72h。
13、s2、原代組織的構建：將腫瘤組織傳到潔凈實驗室中，通過反復清洗、消化直至得到腫瘤細胞，接著進行過濾離心，棄上清備用，然后在細胞沉淀中加入對應的基質膠，最后將其置于類器官種板中，并加入乳腺癌類器官培養基進行培養；
14、進一步地，所述s2中原代組織的構建方法具體包括以下步驟：
15、s201、登記好患者信息后，將腫瘤組織傳到潔凈實驗室中，并消毒后放到超凈工作臺中，準備三個培養皿，并倒入加1%抗生素的pbs；
16、s202、將腫瘤組織浸泡于第一個皿中，充分晃動清洗，用鑷子去除死細胞、脂肪組織、肌肉組織、部分血細胞，去除干凈后將樣本轉移到第二個皿中剪成大米粒大小的碎塊，并用含雙抗的pbs充分清洗組織，接著將小腫瘤組織塊轉移至第三個培養皿中繼續充分清洗組織塊，最后將其放入離心管中；
17、s203、將離心管中的組織塊剪碎成粘稠狀且無較大顆粒，接著轉移到腫瘤組織消化液中，并吹打重懸樣品，迅速轉移到搖床中，37℃消化50min，每10min用移液槍捶打一次并取出10ul觀察消化情況，直到腫瘤細胞被大量消化出來且未存在大量腫瘤組織塊為止便可進行下一步操作；
18、s204、消化結束后，向消化液中迅速加入fbs，以終止消化，混勻液體，再用潤洗后的濾網進行過濾，接著收集過濾后的懸液進行離心并棄上清，繼續加入pbs清洗沉淀、離心并棄上清，然后加入pbs重懸細胞，并取一小部分進行細胞計數和死活率計數，其余液體離心棄上清備用；
19、s205、基質膠3d包裹：此實驗步驟在冰上操作，在細胞沉淀中，根據類器官和細胞量加入對應的基質膠，并在冰上緩慢吹打混勻；
20、s206、類器官種板培養：將槍頭吸取細胞外基質和細胞的混合物移至細胞培養孔板底部中央位置，將培養板放入37℃、5%?co2的細胞培養箱中孵育，待細胞外基質膠凝固至不再流動后，加入乳腺癌類器官培養基并將孔板放入37℃、5%?co2的培養箱中培養。
21、s3、乳腺癌類器官換液：從細胞培養箱中取出類器官培養細胞板，在超凈臺中吸出原培養液棄掉，加入新的乳腺癌類器官培養基，且該操作2~3天進行一次；
22、進一步地，所述s3中乳腺癌類器官換液方法具體包括以下步驟：
23、s301、從4℃冰箱中取出乳腺癌類器官培養基于室溫或co2培養箱復溫；
24、s302、從細胞培養箱中取出類器官培養細胞板，在超凈臺中，用移液槍吸出原培養液棄于廢液缸，加入新復溫的乳腺癌類器官培養基即可；
25、s303、換液結束后，于倒置顯本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.乳腺癌類器官的培養基，其特征在于：包括Advanced?DMEM/F12基礎培養基、添加劑；
2.根據權利要求1所述的乳腺癌類器官的培養基，其特征在于：所述的添加劑的組分終濃度包括0.5-1.5X的青鏈霉素/兩性霉素B、0.5-1.5X的B-27?添加劑、0.5-1.5X的L-谷氨胺酰胺、9-12mM的HEPES、1-1.5mM的N-Acetylcysteine、4-6mM的nicotinamide、450-550nM的SB202190、450-550nM的A83-01、45-55ng/ml的FGF10、4-6ng/ml的EGF、4-6nM的humanHeregulinβ-1、9-12uM的Y27632、0.4-0.6ug/ml的WNT-3A、0.4-0.6ug/ml的R-spondin?1、0.05-0.12ug/ml的NOGGIN、18-22ng/ml的FGF7、180-220nM的β-estradiol。
3.根據權利要求1所述的乳腺癌類器官的培養基，其特征在于：所述的添加劑的組分終濃度包括1X的青鏈霉素，兩性霉素B、1X的B-27?添加劑、1X
4.乳腺癌類器官的培養方法，包括使用本專利技術所述的乳腺癌類器官培養基，其特征在于，所述方法具體包括以下步驟：
5.根據權利要求4所述的乳腺癌類器官的培養方法，其特征在于：所述S1中的取材方法具體包括以下步驟：
6.根據權利要求4所述的乳腺癌類器官的培養方法，其特征在于：所述S2中原代組織的構建方法具體包括以下步驟：
7.根據權利要求4所述的乳腺癌類器官的培養方法，其特征在于：所述S3中乳腺癌類器官換液方法具體包括以下步驟：
8.根據權利要求4所述的乳腺癌類器官的培養方法，其特征在于：所述S4中乳腺癌類器官傳代培養方法具體包括以下步驟：
...【技術特征摘要】
1.乳腺癌類器官的培養基，其特征在于：包括advanced?dmem/f12基礎培養基、添加劑；
2.根據權利要求1所述的乳腺癌類器官的培養基，其特征在于：所述的添加劑的組分終濃度包括0.5-1.5x的青鏈霉素/兩性霉素b、0.5-1.5x的b-27?添加劑、0.5-1.5x的l-谷氨胺酰胺、9-12mm的hepes、1-1.5mm的n-acetylcysteine、4-6mm的nicotinamide、450-550nm的sb202190、450-550nm的a83-01、45-55ng/ml的fgf10、4-6ng/ml的egf、4-6nm的humanheregulinβ-1、9-12um的y27632、0.4-0.6ug/ml的wnt-3a、0.4-0.6ug/ml的r-spondin?1、0.05-0.12ug/ml的noggin、18-22ng/ml的fgf7、180-220nm的β-estradiol。
3.根據權利要求1所述的乳腺癌類器官的培養基，其特征在于：所述的添加劑的組分終濃度包括1x的青鏈霉素，兩性霉素b、1x的b-27?添加劑、1x的l-谷氨胺酰胺、10mm的hepe...
【專利技術屬性】
技術研發人員：戴永琴，李章倩，趙樹凡，黃雁林，張濟斌，顧夢琪，陳姜蓉，姜江，
申請(專利權)人：云南醫大精準生命科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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