【技術實現步驟摘要】
本申請涉及酵母中蛋白互作的，具體涉及酵母雙表達載體及其構建方法、蛋白互作鑒定方法及應用。
技術介紹
1、蛋白質與蛋白質之間相互作用構成了細胞生化反應網絡的一個主要組成部分，蛋白-蛋白互作網絡與轉錄調控網絡對調控細胞及其信號有重要意義。
2、酵母雙雜交系統是當前廣泛用于蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法。其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合后，誘餌蛋白結合于報道基因的啟動子，啟動報道基因在酵母細胞內的表達，如果檢測到報道基因的表達產物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術微量化、陣列化后則可用于大規模蛋白質之間相互作用的研究。目前使用的酵母雙表達載體主要是基于酶切-連接和gateway這兩種克隆技術，存在操作繁瑣或試劑昂貴等問題。
3、然而，現有技術提供的酵母雙雜交在對蛋白互作進行鑒定時，需要將被研究的外源基因分別構建至少兩個載體上，例如一個捕獲載體和一個誘餌載體。并這兩種載體分別轉入兩株酵母菌中進行分別表達并進行雜交培養，以此判斷二者是否雜交。當需要對多對蛋白進行互作鑒定時，就需要相應的構建多個載體。然而，傳統的酵母雙雜交系統會使得多種蛋白或蛋白文庫互作的鑒定工作量急劇增加，工作效率嚴重受限。
技術實現思路
1、本申請專利技術人創造性地將兩個外源基因克隆于同一載體中，并于酵母菌株中同時表達這兩個外源基因，即可進行互相作用鑒定。極大地減少了原有酵母雙雜交系統的質粒構建及提取、文庫備制、酵母雜交以及篩選培養等工作，顯著提高了蛋白互作的
2、為此，本申請至少公開了以下技術方案：
3、一方面提供了一種酵母雙表達載體。該酵母雙表達載體其具有第一序列與第二序列。所述第一序列包括順序連接的第一多克隆位點、gal4激活結構域的編碼區、第一啟動子、第一基因操縱子和基礎載體起始區，所述第一多克隆位點用于插入至少一個第一目的基因，所述第一啟動子、所述gal4激活結構域的編碼區和所述第一多克隆位點的轉錄方向相同，所述第一啟動子用于啟動所述gal4激活結構域的編碼區的表達和/或插入于所述第一多克隆位點的所述第一目的基因的表達。所述第二序列包括順序連接的第二多克隆位點、gal4結合結構域的編碼區、第二啟動子、第二基因操縱子和酵母2u復制起始區，所述第二多克隆位點用于插入至少一個第二目的基因，所述第二多克隆位點、所述gal4結合結構域的編碼區、所述第二啟動子、所述第二基因操縱子和所述酵母2u復制起始區的轉錄方向相同，所述第二啟動子用于啟動所述gal4結合結構域的編碼區的表達和/或插入于所述第二克隆位點的所述第二目的基因的表達。所述第一序列和所述第二序列連接形成一個環狀dna分子，且所述第一序列的轉錄方向與所述第二序列的轉錄方向相反。
4、一方面提供了所述酵母雙表達載體的構建方法。該構建方法包括：經無縫克隆得到所述第一序列和所述第二序列組成的基礎載體；合成所述終止區；以及在所述第一多克隆位點的轉錄終點和所述第二多克隆位點的轉錄終點之間插入所述終止區。
5、本申請中，術語“酵母雙表達載體”為能夠于酵母細胞中同時進行兩個基因的表達，進而利用酵母中的gal4系統對這兩種表達產物進行互相作用鑒定。
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1.酵母雙表達載體，其具有：
2.根據權利要求1所述的酵母雙表達載體，所述酵母雙表達載體還具有終止區，所述終止區位于所述第一序列的轉錄終端與所述第二序列的轉錄終端之間。
3.根據權利要求2所述的酵母雙表達載體，所述終止區如SEQ?ID?NO:11所示。
4.根據權利要求1所述的酵母雙表達載體，所述第一克隆位點和所述第二克隆位點均具有至少兩個限制性內切酶位點。
5.根據權利要求1所述的酵母雙表達載體，所述酵母雙表達載體還具有分別插入至所述第一多克隆位點與所述GAL4激活結構域的編碼區之間、所述第二多克隆位點與所述GAL4結合結構域的編碼區之間的兩個T7啟動子。
6.根據權利要求1所述的酵母雙表達載體，所述GAL4激活結構域的編碼區如SEQ?IDNO:8所示，所述GAL4結合結構域的編碼區如SEQ?ID?NO:13所示。
7.根據權利要求1所述的酵母雙表達載體，所述第一啟動子和所述第二啟動子均為適用于酵母菌的啟動子；
8.根據權利要求1所述的酵母雙表達載體，所述第一基因操縱子包括第一操縱基因及所述第一
9.根據權利要求1所述的酵母雙表達載體，所述基礎載體起始區如SEQ?ID?NO:5所示，所述酵母2U復制起始區如SEQ?ID?NO:3所示。
10.根據權利要求1～9任一所述的酵母雙表達載體，所述第二序列還包括：
11.根據權利要求10所述的酵母雙表達載體，所述抗性基因選自氨芐青霉素(Ampicillin)、四環素(Tetracycline)、氯霉素(Chloramphenicol)、鏈霉素(Streptomycin)、潮霉素(Hygromycin)、壯觀霉素(Spectinomycin)、卡那霉素(Kanamycin)、殺稻瘟菌素(Blasticidin)、遺傳霉素(Geneticin)、潮霉素(Hygromycin?B)、霉酚酸(Mycophenolic?Acid)、嘌呤霉素(Puromycin)、博萊霉素(Zeocin)或新霉素(Neomycin)的編碼基因中的一種。
12.一種酵母雙表達載體的構建方法，其包括：
13.根據權利要求12所述的構建方法，所述基礎載體的構建包括：
14.兩種不同蛋白互作的鑒定方法，包括，
15.根據權利要求14所述的鑒定方法，所述酵母為Y2H型酵母菌。
16.根據權利要求15所述的鑒定方法，所述選擇培養基選自SD/-Leu/-Trp、SD/-His/-Leu/-Trp、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade+3-AT。
17.權利要求1～11任一所述酵母雙表達載體在蛋白互作中的應用。
...【技術特征摘要】
1.酵母雙表達載體，其具有：
2.根據權利要求1所述的酵母雙表達載體，所述酵母雙表達載體還具有終止區，所述終止區位于所述第一序列的轉錄終端與所述第二序列的轉錄終端之間。
3.根據權利要求2所述的酵母雙表達載體，所述終止區如seq?id?no:11所示。
4.根據權利要求1所述的酵母雙表達載體，所述第一克隆位點和所述第二克隆位點均具有至少兩個限制性內切酶位點。
5.根據權利要求1所述的酵母雙表達載體，所述酵母雙表達載體還具有分別插入至所述第一多克隆位點與所述gal4激活結構域的編碼區之間、所述第二多克隆位點與所述gal4結合結構域的編碼區之間的兩個t7啟動子。
6.根據權利要求1所述的酵母雙表達載體，所述gal4激活結構域的編碼區如seq?idno:8所示，所述gal4結合結構域的編碼區如seq?id?no:13所示。
7.根據權利要求1所述的酵母雙表達載體，所述第一啟動子和所述第二啟動子均為適用于酵母菌的啟動子；
8.根據權利要求1所述的酵母雙表達載體，所述第一基因操縱子包括第一操縱基因及所述第一操縱基因的啟動子，所述第二基因操縱子包括第一操縱基因及所述第二操縱基因的啟動子；
9.根據權利要求1所述的酵母雙表達載體，所述基礎載體起始區如seq?id?no:5所示，所述酵母2u復制起始區如seq?id?no:3所示。
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