本發明專利技術公開了一種基于點擊化學反應和表面增強拉曼光譜的單細胞酶活成像檢測系統及其應用，所述單細胞酶活成像檢測系統包括微流控細胞培養裝置、多肽探針和殼層隔絕金屬納米顆粒，所述微流控細胞培養裝置形成封閉的微流控通道控制溶液流速和引導多肽探針、殼層隔絕金屬納米顆粒的引入。本發明專利技術利用點擊化學反應觸發的拉曼信號變化，通過殼層隔絕金屬納米顆粒顯著增強拉曼信號，分析特定基團的拉曼光譜，實現對單細胞內酶活性成像，該方法顯著提高了拉曼光譜的靈敏度和空間分辨率，能夠提供高特異性和高靈敏度的酶活性檢測，為細胞代謝和疾病研究提供了新的工具，并為未來生物傳感技術和診斷方法的開發奠定了基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于領域，尤其涉及一種基于點擊化學反應和表面增強拉曼光譜的單細胞酶活成像檢測系統及其應用。
技術介紹
1、細胞內的酶促過程在調控多種生化途徑和細胞功能中起著至關重要的作用。準確監測酶活性對于研究細胞代謝、信號傳導以及疾病進展具有重要意義。目前，常用的酶活性監測方法包括酶聯免疫吸附試驗(elisa)、生物發光和熒光成像技術。熒光成像因其高靈敏度和活體內可視化能力而被廣泛應用。然而，熒光成像存在一些局限性，如光漂白、自發熒光和發射光譜重疊，導致其多重檢測能力有限。此外，熒光團的尺寸與酶相當，可能會干擾酶的正常功能。這些問題表明有必要開發新的成像方法，能夠在保持高特異性和高靈敏度的同時，不影響空間和時間分辨率。
2、拉曼成像作為熒光成像的有效替代方案，具有光漂白小、背景噪聲低和無光譜重疊等優點。此外，拉曼成像中的成像基團通常是特定的化學鍵(即拉曼標簽)，它們比傳統熒光團小得多，能最大限度減少對酶活性的干擾。盡管如此，拉曼成像在酶活性檢測中的應用仍然有限。目前的方法主要檢測酶促反應的總體產物，而不是特定的酶-底物反應，說明在方法學上需要進一步改進，以便直接將拉曼信號變化與酶促過程相關聯。
3、此外，在現有技術中，缺乏能夠在單細胞水平上進行原位酶活性檢測的裝置，特別是由于細胞間的異質性，這一問題顯得更為突出。目前的方法多依賴于定點取樣，檢測總體酶促反應產物，無法實現單細胞實時、原位的酶活性監測。這種局限性阻礙了對細胞內動態過程的深入理解和精確分析。
技術實現思路
1、專利技術目的：為了解決上述技術問題，本專利技術旨在提供一種檢測單細胞酶活成像系統，解決了無法實現單細胞水平上酶活性原位檢測的問題。
2、本專利技術還提供單細胞酶活成像的檢測方法，本專利技術的微流控細胞培養裝置和方法能夠在高靈敏度和高特異性的條件下，實現對單細胞內酶活性的實時拉曼成像監測。
3、技術方案：為了實現上述目的，本專利技術的提供一種檢測單細胞酶活成像系統，所述檢測系統包括微流控細胞培養裝置、多肽探針和殼層隔絕金屬納米顆粒，所述微流控細胞培養裝置形成封閉的微流控通道控制流速和多肽探針、殼層隔絕金屬納米顆粒的引導。
4、進一步地，所述多肽探針序列為val-cit-cys(stbu)-pra-gly-cbt、cit-val-gly-cys(stbu)-pra-cbt或val-cys(stbu)-pra-gly-cit-cbt中的任意一種或幾種。
5、進一步地，所述pra的側鏈接枝有炔基，cbt的末端含有氰基。
6、進一步地，所述殼層隔絕金屬納米顆粒中金屬納米顆粒為金、銀或銅中的任意一種，所述殼層材質為二氧化硅或氧化鋁中的任意一種。
7、其中，金屬納米顆粒可由種子生長法合成，其尺寸10-80nm；殼層包裹可采用硅源或鋁源的控制水解，在金屬納米顆粒的表面逐漸形成致密的殼層，其厚度為1-20nm。
8、進一步地，所述微流控細胞培養裝置包括微流控軟管、帶孔的pdms塊和打孔玻璃片，將所述pdms塊上的孔與打孔玻璃片上的孔對齊，并將pdms塊貼合在打孔玻璃片兩端形成玻璃流道蓋，再使用防水雙面膠將玻璃流道蓋與經過預處理的石英片基底粘合，形成封閉的微流控通道，在所述pdms塊的孔內插入l型鋼針，用微流控軟管連接微量注射泵和廢液收集瓶。
9、本專利技術中多肽探針在進入細胞后，細胞內高濃度的谷胱甘肽可以將cys上的保護基stbu還原為巰基，活性酶剪切特定底物，從而釋放出cys的氮端，進而與cbt基團發生cbt-cys點擊化學反應，消耗多肽前體分子上的氰基，而pra上的炔基可用作內標峰，二者的拉曼散射信號經殼層隔絕金屬納米顆粒增強后被拉曼成像儀原位采集，從而實現酶活監控。
10、本專利技術微流控細胞培養裝置由以下幾個部分組成：石英基底，經食人魚洗液清洗，保證表面的親水性和清潔度，用于細胞黏附，同時避免熒光干擾；玻璃流道蓋，通過防水雙面膠與石英基底粘合用于流道封裝，其良好的光通透性使其適應于顯微鏡下的長時間監測觀察；包括注射泵在內的流道控制系統，用于控制流速和引導多肽探針、殼層隔絕金屬納米顆粒的引入，以及細胞外液的引入，穩定滲透壓，保證細胞的長時間穩定性。
11、進一步地，所述預處理的石英片基底的處理方法為將石英片浸泡在食人魚洗液中，取出后沖洗，用惰性氣體吹干備用。
12、進一步地，所述食人魚洗液為濃度比3-5:1-3的濃硫酸/雙氧水混合液，所述浸泡時間為8-10分鐘。
13、作為優選，所述食人魚洗液為濃度比3:1的濃硫酸/雙氧水混合液，所述浸泡時間為10分鐘。
14、本專利技術所述單細胞酶活成像系統在檢測單細胞酶活中的應用。
15、進一步地，所述單細胞酶為組織蛋白酶b、酸性磷酸酶、弗林酶或氨基肽酶n中的任意一種或幾種。
16、進一步地，所述應用過程為：待細胞貼壁后，利用注射泵將殼層隔絕金屬納米顆粒引入微流控培養裝置內進行細胞內吞，再引入細胞外液洗去游離的殼層隔絕金屬納米顆粒，然后將微流控細胞培養裝置置于拉曼顯微鏡下，利用注射泵引入多肽探針，通過拉曼成像儀對炔基峰和氰基峰進行實時、原位成像和數據分析。
17、本專利技術提供的基于點擊化學反應和表面增強拉曼光譜的單細胞酶活成像檢測系統的搭建，包括如下步驟：
18、(1)微流控細胞培養裝置的搭建和細胞接種
19、用食人魚洗液對石英基底進行清洗，獲得高度親水、潔凈的表面，通過防水雙面膠將玻璃流道蓋與石英基底粘合，形成封閉的的微流控通道，通道厚度由雙面膠的厚度和層數決定，為50-500μm，通過注射泵將細胞懸液注入流道內，置于細胞培養箱內孵育過夜，從而使細胞貼壁；
20、(2)多肽探針的合成
21、稱取一定量的氨基酸單體，使用固相合成方法在合成樹脂上逐步合成目標多肽序列；完畢后，用釋放試劑將多肽從合成樹脂上切下來，并使用高效液相色譜(hplc)進行純化，得到所需多肽探針；
22、(3)殼層隔絕金屬納米顆粒的合成
23、選用金、銀或銅作為金屬核，二氧化硅或氧化鋁作為殼層材料；首先通過晶種生長法得到金屬核心，然后利用正硅酸四乙酯、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、硅酸鈉、異丙醇鋁中的一種或幾種對其進行殼層包覆，反應溫度25-90攝氏度，反應時間0.5-3小時，反應結束后離心或過濾，用去離子水洗滌三次，即可得到殼層隔絕金屬納米顆粒。
24、本專利技術提供的基于點擊化學反應和表面增強拉曼光譜的單細胞酶活成像檢測系統在檢測單細胞原位酶活拉曼成像的方法如下：
25、待細胞貼壁后，利用注射泵將殼層隔絕金屬納米顆粒引入微流控細胞培養裝置內進行細胞內吞，孵育2-6小時候引入細胞外液洗去游離的殼層隔絕金屬納米顆粒，然后將微流控細胞培養系統置于拉曼顯微鏡下，利用注射泵引入多肽探針，注射流速為0.1-1ml/min。通過拉曼成像儀對炔基峰和氰基峰進行實時、原位成像和數據分析。
26本文檔來自技高網
...
【技術保護點】
1.一種單細胞酶活成像檢測系統，其特征在于，所述檢測系統包括微流控細胞培養裝置、多肽探針和殼層隔絕金屬納米顆粒，所述微流控細胞培養裝置形成封閉的微流控通道控制溶液流速和引導多肽探針、殼層隔絕金屬納米顆粒的引入。
2.根據權利要求1所述單細胞酶活成像檢測系統，其特征在于，所述多肽探針序列為Val-Cit-Cys(StBu)-Pra-Gly-CBT、Cit-Val-Gly-Cys(StBu)-Pra-CBT或Val-Cys(StBu)-Pra-Gly-Cit-CBT中的任意一種或幾種。
3.根據權利要求2所述單細胞酶活成像檢測系統，其特征在于，所述Pra的側鏈接枝有炔基，CBT的末端含有氰基。
4.根據權利要求1所述單細胞酶活成像檢測系統，其特征在于，所述殼層隔絕金屬納米顆粒中金屬納米顆粒為金、銀或銅中的任意一種，殼層為二氧化硅或氧化鋁中的任意一種。
5.根據權利要求1所述單細胞酶活成像檢測系統，其特征在于，所述微流控細胞培養裝置包括微流控軟管(1)、帶孔的PDMS塊(2)和打孔玻璃片(3)，將所述PDMS塊(2)上的孔與打孔玻璃片(3)上的孔對齊，并將PDMS塊(2)貼合在打孔玻璃片(3)兩端形成玻璃流道蓋，再用防水雙面膠(4)將玻璃流道蓋與經過預處理的石英片基底(5)粘合，形成封閉的微流控通道，在所述PDMS塊(2)的孔內插入L型鋼針，用微流控軟管(1)連接微量注射泵和廢液收集瓶。
6.根據權利要求5所述微流控細胞培養裝置，其特征在于，所述預處理的石英片基底(5)的處理方法為將石英片浸泡在食人魚洗液中，取出后沖洗，用惰性氣體吹干備用。
7.根據權利要求6所述微流控細胞培養裝置，其特征在于，所述食人魚洗液為濃度比3-5:1-3的濃硫酸/雙氧水混合液，所述浸泡時間為8-10分鐘。
8.一種權利要求1所述單細胞酶活成像檢測系統在檢測單細胞酶活中的應用。
9.根據權利要求8所述應用，其特征在于，所述單細胞酶為組織蛋白酶B、酸性磷酸酶、弗林酶或氨基肽酶N中的任意一種或幾種。
10.根據權利權利要求8所述應用，其特征在于，所述應用過程為：待單個細胞(6)貼壁后，利用注射泵將殼層隔絕金屬納米顆粒(8)引入微流控培養裝置內進行細胞內吞，再引入細胞外液洗去游離的殼層隔絕金屬納米顆粒(8)，然后將微流控細胞培養裝置置于拉曼顯微鏡下，利用注射泵引入多肽探針(7)，通過拉曼成像儀對炔基峰和氰基峰進行實時、原位成像和數據分析。
...
【技術特征摘要】
1.一種單細胞酶活成像檢測系統，其特征在于，所述檢測系統包括微流控細胞培養裝置、多肽探針和殼層隔絕金屬納米顆粒，所述微流控細胞培養裝置形成封閉的微流控通道控制溶液流速和引導多肽探針、殼層隔絕金屬納米顆粒的引入。
2.根據權利要求1所述單細胞酶活成像檢測系統，其特征在于，所述多肽探針序列為val-cit-cys(stbu)-pra-gly-cbt、cit-val-gly-cys(stbu)-pra-cbt或val-cys(stbu)-pra-gly-cit-cbt中的任意一種或幾種。
3.根據權利要求2所述單細胞酶活成像檢測系統，其特征在于，所述pra的側鏈接枝有炔基，cbt的末端含有氰基。
4.根據權利要求1所述單細胞酶活成像檢測系統，其特征在于，所述殼層隔絕金屬納米顆粒中金屬納米顆粒為金、銀或銅中的任意一種，殼層為二氧化硅或氧化鋁中的任意一種。
5.根據權利要求1所述單細胞酶活成像檢測系統，其特征在于，所述微流控細胞培養裝置包括微流控軟管(1)、帶孔的pdms塊(2)和打孔玻璃片(3)，將所述pdms塊(2)上的孔與打孔玻璃片(3)上的孔對齊，并將pdms塊(2)貼合在打孔玻璃片(3)兩端形成玻璃流道蓋，再...
【專利技術屬性】
技術研發人員：周思思，王睿，
申請(專利權)人：東南大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。