【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于果蔬病害檢測鑒別，涉及一種獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法以及軟腐病的鑒別方法。
技術介紹
1、獼猴桃(actinidia?chinensis?planch.)為獼猴桃科獼猴桃屬，起源于中國，已成為我國重要經濟林水果之一，廣泛種植于陜西、四川、貴州等地。獼猴桃質地柔軟、酸甜可口、果香濃郁、風味獨特，富含維生素c、葉酸、胡蘿卜素、氨基酸、微量元素等，營養價值遠超其他水果；因其宜人的感官特性和出色的營養品質，素有“維c之冠”，深受世界各國消費者青睞。然而獼猴桃作為一種典型的呼吸躍變型水果，且屬于皮薄多汁的漿果，貯藏過程中后熟明顯，易受到病原菌侵害，引起果實軟爛變質，損失率極高。目前軟腐病已成為造成采后獼猴桃腐敗的最重要病害之一，主要由葡萄座腔菌(botryosphaeria?dothidea)、間座殼菌(diaporthe)、鏈格孢菌(alternaria?alternata)等病原真菌引起。此外，軟腐病病原菌侵染獼猴桃時，前期難以診斷，多發生在幼果期，而后長期潛伏，直至采后獼猴桃后熟時逐漸表現出相應病癥，采后獼猴桃軟腐病的極易發病且侵染迅速，成為當前健康穩定發展獼猴桃產業亟待解決的技術難題。
2、現階段獼猴桃軟腐病的鑒定方法主要有電子鼻和氣相色譜串聯質譜(gc-ms)檢測方法，但由于電子鼻選擇特異性和辨識能力有限，gc-ms需要復雜樣品前處理操作且分析過程耗時費力，對于獼猴桃采后貯藏過程中的揮發性成分監測能力有限，導致獼猴桃軟腐病的鑒定存在檢測時間長、準確性差以及靈敏性較低的問題。
3、
技術實現思路
1、針對
技術介紹
中所描述的，獼猴桃軟腐病鑒定存在的技術問題，本專利技術提供一種獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法以及軟腐病的鑒別方法。
2、本專利技術先識別出獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物，進而通過識別的揮發性生物標志物來鑒別獼猴桃是否發生軟腐病，具有快速、準確、靈敏的特點，能實現獼猴桃軟腐病的監測與預警。
3、為了實現上述目的，本專利技術采用的技術方案是：
4、一種獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法，包括以下步驟：
5、s1、獼猴桃選取與處理
6、選取一批大小均一、無病斑和機械損傷的獼猴桃，消毒滅菌后，晾干；
7、s2、接種病原真菌
8、s21、將晾干后的獼猴桃進行分組，并設置健康對照組和接病菌組；
9、s22、接病菌組，每個獼猴桃接種濃度1×105個/ml、10μl孢子懸浮液，孢子懸浮液是由引起軟腐病的病原真菌制備而成的；健康對照組，每個獼猴桃接種10μl的無菌水；接種后分別置于恒溫恒濕培養箱中進行貯藏；
10、s23、在貯藏過程中每天隨機從接病菌組和健康對照組抽取獼猴桃，得到健康對照樣品和病菌樣品；
11、s3、gc-ims檢測
12、對上述每天抽取的健康對照樣品和病菌樣品，均采用頂空進樣方式進入gc-ims分析儀中，利用gc-ims分析儀分別得到健康對照樣品中揮發性成分的三維譜圖以及病菌樣品中揮發性成分的三維譜圖；gc-ims分析儀的參數條件為：氣相色譜柱為mxt-5，柱溫為60℃，載氣為高純氮99.999％，載氣流速初始為2ml/min，保持2min，隨后18min內線性梯度升至100ml/min，漂移管長度9.8cm、溫度為45℃，漂移氣為高純氮99.999％、流速為150ml/min，管內線性電壓為510v/cm；
13、s4、揮發性生物標志物識別
14、s41、將上述得到的三維譜圖均進行投影，對應得到健康對照樣品中揮發性成分的二維譜圖以及病菌樣品中揮發性成分的二維譜圖；
15、s42、結合vocal軟件中nist數據庫和ims數據庫對上述得到的二維譜圖上的揮發性成分分別進行定性；
16、s43、依據不同侵染時期和重復次數，并利用vocal軟件中gallery?plot插件將定性后的揮發性成分進行重新排列，分別繪制得到健康對照樣品的特征指紋圖譜以及病菌樣品的特征指紋圖譜；
17、s44、以健康對照樣品的特征指紋圖譜作為基準，從病菌樣品的特征指紋圖譜中識別出健康對照樣品的特征指紋圖譜中未發現的揮發性成分，完成獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別。
18、進一步限定，所述步驟s22中，所述引起軟腐病的病原真菌為葡萄座腔菌、間座殼菌或鏈格孢菌。
19、進一步限定，所述步驟s23中，培養溫度為25±1℃，培養濕度為85±5％，培養時間為7天。
20、進一步限定，所述頂空進樣方式的參數為：稱取待分析樣品1～2g置于20ml頂空瓶中，密封后于40～50℃、攪拌速率450～550r/min條件下平衡孵育12～18min后，85℃頂空進樣500μl。
21、進一步限定，所述引起軟腐病的病原真菌為葡萄座腔菌時，識別出的獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物包括：4-甲基-1-戊醇、丙酸異丁酯、1,3-丁二醇、5-甲基糠醛、甲基環戊烯醇酮、水楊醛、2,6-二甲基吡嗪、乳酸乙酯、3-庚烯-2-酮、薄荷腦、2-甲基丁醛、2,4,5-三甲基噻唑、苯乙烯、2-甲基丁酸乙酯、α-萜品烯和α-萜品油烯；
22、所述引起軟腐病的病原真菌為間座殼菌時，識別出的獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物包括：γ-萜品烯、α-萜品烯、α-萜品油烯、薄荷腦、4-甲基苯甲醛、丁位己內酯、甲基丙烯酸甲酯、3-庚烯-2-酮、1-戊烯-3-醇、1,1-二乙氧基乙烷、羥基丙酮、2-戊酮、乳酸乙酯、1,3-丁二醇、苯乙烯、2,3-戊二酮、4-甲基苯酚、5-甲基糠醛、苯甲醛丙二醇縮醛、水楊醛、甲酸丁酯、2,6-二甲基吡嗪、糠醇、2-甲基丁酸乙酯、甲基環戊烯醇酮、γ-戊內酯和2,4,5-三甲基噻唑；
23、所述引起軟腐病的病原真菌為鏈格孢菌時，識別出的獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物包括：丙酸異丁酯、4-甲基-1-戊醇、3-庚烯-2-酮、2-甲基丁酸乙酯、甲基環戊烯醇酮、水楊醛、4-甲基苯酚、乳酸乙酯、2,6-二甲基吡嗪、1,3-丁二醇、苯乙烯和苯甲醛丙二醇縮醛。
24、進一步限定，所述獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法還包括以下步驟：
25、對于健康對照樣品中揮發性成分的二維譜圖以及病菌樣品中揮發性成分的二維譜圖；采用vocal軟件中的主成分分析和歐氏距離分析，對應得到pc1×pc2評分圖和歐氏距離圖；通過比較不同貯藏時間下揮發性成分之間的差異，確定出病原真菌侵染獼猴桃發病的關鍵時間點。
26、一種獼猴桃軟腐病的鑒別方法，包括以下步驟：
27、a1、對隨機采集的獼猴桃待測樣品，經消毒滅菌后，晾干；
28、a2、獼猴桃待測樣品，采用頂空進樣方式進入gc-ims分析儀中；利用gc-ims分析儀得到獼猴桃待測樣品中揮發性成分的三本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法，其特征在于，所述步驟S22中，所述引起軟腐病的病原真菌為葡萄座腔菌、間座殼菌或鏈格孢菌。
3.根據權利要求1所述的獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法，其特征在于，所述步驟S23中，培養溫度為25±1℃，培養濕度為85±5％，培養時間為7天。
4.根據權利要求1所述的獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法，其特征在于，所述頂空進樣方式的參數為：稱取待分析樣品1～2g置于20mL頂空瓶中，密封后于40～50℃、攪拌速率450～550r/min條件下平衡孵育12～18min后，85℃頂空進樣500μL。
5.根據權利要求2所述的獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法，其特征在于，所述引起軟腐病的病原真菌為葡萄座腔菌時，識別出的獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物包括：4-甲基-1-戊醇、丙酸異丁酯、1,3-丁二醇、5-甲基糠醛、甲基環戊烯醇酮、水楊醛、2,6-二甲基吡嗪、乳酸乙酯、3-庚烯-2-酮、薄荷腦
6.根據權利要求2所述的獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法，其特征在于，所述獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法還包括以下步驟：
7.一種獼猴桃軟腐病的鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.根據權利要求7所述的獼猴桃軟腐病的鑒別方法，其特征在于，所述頂空進樣方式的參數為：稱取待分析樣品1～2g置于20mL頂空瓶中，密封后于40～50℃、攪拌速率450～550r/min條件下平衡孵育12～18min后，85℃頂空進樣500μL。
...【技術特征摘要】
1.一種獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法，其特征在于，所述步驟s22中，所述引起軟腐病的病原真菌為葡萄座腔菌、間座殼菌或鏈格孢菌。
3.根據權利要求1所述的獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法，其特征在于，所述步驟s23中，培養溫度為25±1℃，培養濕度為85±5％，培養時間為7天。
4.根據權利要求1所述的獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法，其特征在于，所述頂空進樣方式的參數為：稱取待分析樣品1～2g置于20ml頂空瓶中，密封后于40～50℃、攪拌速率450～550r/min條件下平衡孵育12～18min后，85℃頂空進樣500μl。
5.根據權利要求2所述的獼猴桃軟腐病揮發性生物標志物的識別方法，其特征在于，所述引起軟...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孔慶軍，高慶超，任雪艷，李雪，王龍飛，
申請(專利權)人：陜西師范大學，
類型：發明
國別省市：
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