【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物分析檢測，具體涉及ecl生物傳感器及其在用于微囊藻毒素mc-lr的檢測中的應用。
技術介紹
1、微囊藻毒素(microcystis,?mcs)是一種單環七肽，主要由銅綠微囊藻產生，是目前分布最廣泛的肝毒素，對飲用水水質構成嚴重威脅。在mcs的多種同分異構體中存在最普遍、含量較多的是mc-lr、mc-rr和mc-yr?(l、r和y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸)三種微囊藻毒素。研究證實，mc-lr毒性最強，mc-yr次之，rr最弱。mcs通過抑制蛋白磷酸酶的活性，導致肝臟結構的快速破壞，這通常會導致低血容量性休克或肝功能不全而死亡。越來越多的研究表明，人類長期暴露在低濃度的mcs環境中，容易患肝癌。
2、隨著氣候變暖和水生生態系統的水體富營養化，藍藻水華現象日益增多，引起了全世界的關注。被人體吸收后可導致疾病和死亡的mc-lr主要來源于食用海產品、農業植物和飲用水等。人類食用之后會抑制蛋白磷酸化酶(pp1以及pp2a）的絲氨酸/蘇氨酸殘基的活性，從而導致胞內蛋白磷酸化和去磷酸化水平失衡、細胞骨架改變,并且引起dna損傷和細胞凋亡。此外，mc-lr還特異性地靶向肝臟和腎臟細胞誘導胚胎和神經毒性。在2010年就已經被國際癌癥研究機構列為2b類致癌物。世界衛生組織還規定飲用水中微囊藻毒素mc-lr不應超過1μg/l。水質安全關乎人類生命健康，因此，開發高靈敏度和特異性的mc-lr傳感器，用于水體監測和流行病學毒理學研究迫在眉睫。
3、電化學發光（ecl）因其檢測成本低、操作簡單、靈敏度高在一眾檢
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于構建一種用于檢測微囊藻毒素的ecl生物傳感器，該傳感器是基于原位還原的dgb@aunc的檢測策略，同時采用t7?exo循環酶切的循環手段，用微量的微囊藻毒素就可以實現較強的信號輸出，有利于對感染早期樣本的快速檢測。具體的，本專利技術的技術方案如下：
2、本專利技術的一種用于檢測微囊藻毒素mc-lr的ecl生物傳感器，采用下述方法制備得到：
3、（1）利用padlock鏈和primer鏈在t4連接酶、phi29酶和dntp作用下制備dna凝膠球dgb；
4、（2）利用haucl4、檸檬酸三鈉在凝膠球上原位還原合成金納米簇，得到綻放的納米凝膠球dgb@auncs；
5、（3）利用微囊藻毒素mc-lr打開發夾h1，使得發夾h1暴露出一段序列接在發夾h2上組成mc-lr-h1-h2；
6、（4）利用t7?exo將mc-lr-h1-h2切割得到酶切產物f1鏈；
7、（5）在預處理的電極上進行電鍍銀納米膜，再將發夾h3修飾于電極表面并加入mch防止特異性結合；
8、（6）向電極加入步驟（4）得到的f1鏈，使打開發夾h3；
9、（7）向電極加入步驟（2）綻放的納米凝膠球dgb@auncs，進行電化學發光檢測。
10、對于上述所述ecl生物傳感器，其中，優選的，步驟（1）先將padlock鏈和primer鏈同時在85-95℃下退火結合并冷卻至室溫，再加入t4連接酶反應，然后再與phi29酶和dntp反應。
11、對于上述所述ecl生物傳感器，其中，優選的，步驟（2）是將0.8-1.2?mm的氯金酸haucl4溶液和凝膠球dgb充分混合，然后加入100?mm檸檬酸三鈉緩沖液(ph?=?6)，80-95℃下攪拌混合冷卻。
12、對于上述所述ecl生物傳感器，其中，優選的，步驟（3）是將微囊藻毒素（mc-lr）與退火后的h1、h2一起在35-38℃孵育2-4h形成mc-lr-h1-h2。
13、對于上述所述ecl生物傳感器，其中，優選的，步驟（4）是在ep管內加入mc-lr-h1-h2和t7?exo，利用t7?exo酶從5’端切割平末端的特點，得到切割后的產物f1。
14、對于上述所述ecl生物傳感器，其中，優選的，步驟（5）電鍍銀納米膜是將電極置于電解液中，在0.1-0.5?v恒定電位下沉積，得到三維分層銀納米膜；所述電解液包括4-6?mmagno3,?0.15-0.25?m?kno3,?0.6-1.5?mm檸檬酸鈉二水合物，2-3?g/l聚乙烯吡羅烷酮。將發夾h3修飾于電極表面，是將發夾h3置于電極上孵育。電極先進行沉積銀納米，然后再修飾發夾，這是發夾修飾所通常的做法，其原理一般就是基于銀硫鍵的結合，使得含有巰基的發夾h3修飾到了鍍有銀的電極上。
15、對于上述所述ecl生物傳感器，其中，優選的，步驟（7）所述電化學發光檢測是將電極置于0.03-0.08mm?k2s2o8中，在-2v-0v下，光電倍增管為700-800v時進行ecl測量。
16、作為更為優選的一種技術方案，本專利技術所述的ecl生物傳感器，其采用下述方法制備得到：
17、（1）將10μl、10μm的padlock鏈和10μl、10μm的primer鏈混合在10mm?mg2+溶液中，加熱至95℃退火處理5min冷至室溫；加入0.2u的t4連接酶在16℃下孵育過夜，65℃滅活t4連接酶后再加入5μl、10u/μl的phi29?dna聚合酶和10ml、10mm的dntp，在30℃下孵育24h，最后對反應中所使用的酶進行65℃滅活，將所得到的產品在10000rpm，10min下離心收集并且用超純水清洗3次，然后分散在500μl的超純水中，4℃保存備用。該步驟中padlock和primer在8-12mm?mg2+的作用下，一起退火緩慢降溫為佳。
18、（2）將50μl?1?mm氯金酸(haucl4)溶液和50μl制備好的凝膠球（dgb）加入0.85?ml超純水中充分混合，然后加入50μl新配制的100?mm檸檬酸三鈉緩沖液(ph?=?6)。將混合物在90℃下攪拌30?min?(800?rpm)，冷卻至室溫，4℃保存待用，合成dgb@auncs，置于4℃冰箱中備用。
19、（3）將微囊藻毒素（mc-lr）與退火后的h1、h2一起在37℃孵育3h形成mc-lr-h1-h2，置于4℃保存。
20、（4）在ep管內加入mc-lr-h1-h2和0.21u的t7?exo，利用t7?exo從5’端切割平末端的特點，取切割后的產物f1。該步驟酶切時溫度在20-30℃下進行為佳。
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【技術保護點】
1.一種用于檢測微囊藻毒素MC-LR的ECL生物傳感器，采用下述方法制備得到：
2.如權利要求1所述ECL生物傳感器，其特征在于，步驟（1）先將兩條Padlock鏈和Primer鏈同時在85-95℃下退火結合并冷卻至室溫，再加入T4連接酶反應，然后再與phi29酶和dNTP反應。
3.如權利要求1所述ECL生物傳感器，其特征在于，步驟（2）是將0.8-1.2?mM的氯金酸HAuCl4溶液和凝膠球DGB充分混合，然后加入pH=6的100?mM檸檬酸三鈉緩沖液，80-95℃下攪拌混合冷卻。
4.如權利要求1所述ECL生物傳感器，其特征在于，步驟（3）是將微囊藻毒素MC-LR與退火后的發夾H1、發夾H2一起在35-38℃孵育2-4h形成MC-LR-H1-H2。
5.如權利要求1所述ECL生物傳感器，其特征在于，步驟（4）是在ep管內加入MC-LR-H1-H2和T7?EXO，利用T7?EXO從5’端切割平末端的特點，得到切割后的產物F1。
6.如權利要求1所述ECL生物傳感器，其特征在于，步驟（5）電鍍銀納米膜是將電極置于電解液
7.如權利要求1-6任一項所述的ECL生物傳感器，其特征在于，采用下述方法制備得到：
8.權利要求1-7任一項所述ECL生物傳感器在檢測微囊藻毒素中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，將電極置于0.03-0.08mM?K2S2O8中，在-2V-0V下，光電倍增管為700-800V時進行ECL測量。
...【技術特征摘要】
1.一種用于檢測微囊藻毒素mc-lr的ecl生物傳感器，采用下述方法制備得到：
2.如權利要求1所述ecl生物傳感器，其特征在于，步驟（1）先將兩條padlock鏈和primer鏈同時在85-95℃下退火結合并冷卻至室溫，再加入t4連接酶反應，然后再與phi29酶和dntp反應。
3.如權利要求1所述ecl生物傳感器，其特征在于，步驟（2）是將0.8-1.2?mm的氯金酸haucl4溶液和凝膠球dgb充分混合，然后加入ph=6的100?mm檸檬酸三鈉緩沖液，80-95℃下攪拌混合冷卻。
4.如權利要求1所述ecl生物傳感器，其特征在于，步驟（3）是將微囊藻毒素mc-lr與退火后的發夾h1、發夾h2一起在35-38℃孵育2-4h形成mc-lr-h1-h2。
5.如權利要求1所述ecl生物傳感器，其特征在于，步驟（4）是在...
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