【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物分析檢測，具體涉及sers-ecl雙模生物傳感器及其在制備用于脂多糖lps的檢測體系中的應用。
技術介紹
1、致病性細菌感染和相關食源性疾病在世界范圍內構成了重大的公共衛生問題，檢測和鑒定這些細菌病原體對于采取治療方案和建立適當的控制措施至關重要。革蘭氏陰性菌常見于環境中。多年來，它們與革蘭氏陽性或其他類型的微生物的早期有效識別和區分越來越受到關注。
2、脂多糖(lps)是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，也是先天免疫系統的主要靶點。巨噬細胞、粒細胞和樹突狀細胞對lps的識別以及隨后觸發和激活細胞內信號轉導級聯是激活早期先天宿主防御革蘭氏陰性菌入侵的主要原因。由于脂多糖在革蘭氏陰性菌上是一種獨特的病原體相關分子模式，因此有可能將其作為革蘭氏陰性菌鑒定的目標生物標志物。
3、近年來開發出不少的lps檢測方法，但是與單模輸出生物傳感器相比，雙模生物傳感器越來越受到研究人員的關注和青睞。這是因為兩種檢測系統有獨立的信號轉導通道，可以對人為或外界環境造成的誤差進行校正，提高傳感器的精度。在眾多的雙模檢測方法中，由于sers具有極好的靈敏度和響應速度等優點，通常被選擇作為雙模傳感器之一。近年來，在生物傳感器中，ecl作為一種新興的光學分析工具也引起了人們的研究興趣。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于利用sers和ecl兩種互補的模式實現對脂多糖lps的靈敏檢測。本專利技術設計基于雙功能核酸鏈作用于au@agnc的檢測策略，構建了一種用于檢測脂多糖的s
2、本專利技術的一種用于檢測脂多糖的sers-ecl雙模生物傳感器，其采用下述方法制備得到：
3、（1）制備修飾拉曼染料的au@ag?nc納米立方；
4、（2）利用模板鏈和引物鏈在t4連接酶、外切酶i（exoi）和外切酶iii（exoiii）作用下制備圓形模板；
5、（3）將發夾hp修飾于電極表面并加入mch防止非特異性結合；
6、（4）將脂多糖適配體lba與探針n退火孵育，然后再與脂多糖一起孵育釋放探針n，再加入phi29酶、dntp、mg2+和步驟（2）圓形模板在電極上孵育，進行滾環擴增反應;
7、（5）向電極加入步驟（1）得到的修飾拉曼染料的au@ag?nc納米立方，刻蝕。
8、對于上述所述sers-ecl雙模生物傳感器，其中，優選的，步驟（1）先制備金納米粒子aunps，然后再制備au@ag?nc納米立方，其為銀包金納米結構。
9、對于上述所述sers-ecl雙模生物傳感器，其中，優選的，步驟（2）先將模板鏈和引物鏈同時在85-95℃下退火結合并冷卻至室溫再向其中加入酶。
10、對于上述所述sers-ecl雙模生物傳感器，其中，優選的，步驟（3）將發夾hp修飾于電極表面，是將發夾hp置于電極上孵育。電極先進行沉積金，然后再修飾發夾，這是發夾修飾所通常的做法，其原理一般就是基于金硫鍵的結合，使得含有巰基的發夾hp修飾到了沉積金的電極上。
11、對于上述所述sers-ecl雙模生物傳感器，其中，優選的，步驟（4）釋放探針n后進行超濾管離心取清液。
12、作為一種更為優選的技術方案，本專利技術所述的sers-ecl雙模生物傳感器，可采用下述方法制備得到：
13、（1）合成au@ag?nc納米立方：先在haucl4和ctac的水溶液中加入nabh4，得到au種子；然后采用haucl4、ctac（十六烷基三甲基氯化銨）、aa（抗壞血酸）溶液與au種子混合得到aunps；將agno3溶液和ctac溶液與aunps混合，再加入過量的aa混合得到au@ag?nc納米立方，然后加入拉曼染料4-ntp（4-硝基苯硫酚）得到修飾拉曼染料的au@ag?nc納米立方；
14、（2）在ep管內形成圓形模板：將(10μl，10μm)模板鏈與(10μl，10μm)引物鏈和10mmmg2+置于90℃中退火10min并冷卻至室溫后加入0.2u的t4連接酶，16℃過夜反應，再加入0.2u的外切酶i和0.2u的外切酶iii剪切未反應的dna鏈以及反應副產物，最后再進行65℃，20min的酶滅活；將所形成的圓形模板置于4℃冰箱中儲存為佳。
15、（3）將電極置于haucl4電解液電化學沉積60s待干，再加(10μl?3μm?)發夾hp于電極上孵育4h-6h，再加1mm的mch?孵育30min，防止非特異性結合；
16、（4）將(10μl，10μm)脂多糖適配體lba與(10μl，10μm)探針n在10mm?mg2+的作用下37℃下孵育3h，再與20μl脂多糖在37℃孵育1h，用超濾管離心后取清夜，加入0.01u的phi29酶、0.02mm?的dntp、10mm的mg2+和(10μl,?10nm)步驟（2）圓形模板，在ep管內進行37℃滾環擴增反應1h，反應結束后將ep管置于65℃，15min滅活酶；
17、（5）加入10μl拉曼染料修飾的au@ag?nc，室溫黑暗下刻蝕4-6h，觀察發現溶液從橙色變為微粉色。
18、對于上述所述的sers-ecl雙模生物傳感器，其中優選的，步驟（1）au@ag?nc的合成可根據文獻方法，其可分為三步：第一步是ctac包封的金納米粒子的制備，首先，在haucl4（0.25mm）和ctac(100mm)的10ml水溶液中加入0.6ml冰的nabh4，得到3nm的au種子。然后將au種子置于27℃下陳化3h以確保nabh4完全分散從而生成由ctac覆蓋的au種子。第二步為金種子生長，取haucl4（6ml，0.5mm），ctac（6ml，200mm）,aa（4.5ml，100mm）加入（3ml，3nm）au種子中混合以得到更大顆粒的aunps，最后將產物置于14500rpm下離心30min進行水洗。第三步是au@ag納米立方的制備，將一定量的agno3（10mm)溶液和ctac（40mm)溶液按照1：1的體積比混合，加入至生長后的aunps，升溫至60℃，然后再加入過量的aa在60℃下攪拌4h得到au@agnc，離心洗滌最后分散在10ml?ctac溶液中。
19、另外，步驟（1）中，拉曼染料4-ntp以10-4?m為佳。同時，將au@ag?nc與10-4?m的4-ntp室溫下攪拌過夜，修飾拉曼染料。最后，洗滌多余的染料，置于4℃冰箱中備用。
20、另外，本專利技術還提供了所述的sers-ecl雙模生物傳感器在檢測脂多糖中的應用。優選的，進行sers檢測是采用785nm的激光，激光強度10%，掃描次數3次，掃描時間10s。另一方面，進行ecl檢測是在電極上加入6μl，100μm的agno3黑暗中孵育30min，再加入6μl，100μm的nabh4黑暗中還原2h，最后在0.05mm?k2s2o8中800v進行掃描測量，掃描范圍是-1.6v-0v。
21、作為優選，上述所述s本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于檢測脂多糖的SERS-ECL雙模生物傳感器，采用下述方法制備得到：
2.如權利要求1所述SERS-ECL雙模生物傳感器，其特征在于，步驟（1）先制備金納米粒子AuNPs，然后再制備Au@AgNC納米立方。
3.如權利要求1所述SERS-ECL雙模生物傳感器，其特征在于，步驟（2）模板鏈和引物鏈在85-95℃下退火處理。
4.如權利要求1所述SERS-ECL雙模生物傳感器，其特征在于，步驟（3）將發夾HP修飾于電極表面，是將發夾HP置于電極上孵育。
5.如權利要求1所述SERS-ECL雙模生物傳感器，其特征在于，步驟（4）釋放探針N后進行超濾管離心取清液。
6.如權利要求1所述的SERS-ECL雙模生物傳感器，其特征在于，采用下述方法制備得到：
7.權利要求1-6所述的SERS-ECL雙模生物傳感器在檢測脂多糖中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，進行SERS檢測是采用785nm的激光，激光強度10%，掃描次數3次，掃描時間10s。
9.如權利要求7所述的應用，
...【技術特征摘要】
1.一種用于檢測脂多糖的sers-ecl雙模生物傳感器，采用下述方法制備得到：
2.如權利要求1所述sers-ecl雙模生物傳感器，其特征在于，步驟（1）先制備金納米粒子aunps，然后再制備au@agnc納米立方。
3.如權利要求1所述sers-ecl雙模生物傳感器，其特征在于，步驟（2）模板鏈和引物鏈在85-95℃下退火處理。
4.如權利要求1所述sers-ecl雙模生物傳感器，其特征在于，步驟（3）將發夾hp修飾于電極表面，是將發夾hp置于電極上孵育。
5.如權利要求1所述sers-ecl雙模生物傳感器，其特征在于，步驟（4）釋放探針n后進行超濾管離心...
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