【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥領域，具體涉及一種dar1抗體藥物偶聯物及其制備方法和應用。
技術介紹
1、抗體藥物偶聯物是指治療藥物與靶標特異性抗體連接，將藥物導向靶標并釋放產生治療效果的一組治療藥物。開發新的adc作為治療藥物具有重要意義。然而，傳統的偶聯過程會隨機將藥物部分偶聯在抗體的不同位點，從而導致偶聯產品的異質性。根據反應條件，異質性的偶聯物通常含有0至約8個或更多連接藥物部分的抗體分布。這種混合物中的每種結合產物可能具有不同的藥代動力學、分布、毒性和有效性特征。
2、同質性改善的抗體藥物偶聯物在治療中獲益，例如更高的治療指數、改善療效和降低藥物毒性。同質抗體偶聯物在診斷和成像應用中也提供了更準確的結果。因此，制備工藝簡單，成本可控的制備高均一性adcs的新工藝是非常必要且需要長期追求的。
3、近年來，隨著偶聯技術的突破、新型連接子以及有效載荷的引入，新一代的adc表現出更為優異的特異性和細胞毒性。盡管如此，在開發adc藥物時仍然存在許多挑戰，包括如何通過進一步優化抗體偶聯載荷比例，提高載荷的“利用率”，進而在增加藥物療效的前提下，降低因特殊載荷治療窗狹窄而出現的藥物安全性風險，是當前adc藥物研發過程中的重中之重。
4、當前全球共有14款adc藥物獲批，百余個adc藥物處于不同臨床研究階段。在目前adc藥物的研發考慮中，一個重要的adc參數是藥物抗體比值(dar)，其通常在2和8之間變化，取決于有效載荷細胞毒性；最不強效的有效載荷，如拓撲異構酶1抑制劑(sn-38，dxd)通常以高載藥量(
5、dean,a.q?et?al等報道了一種二硫鍵橋接策略，使用雙馬來酰亞胺吡咯苯并二氮雜卓(pbd)二聚體(sg3710)和工程抗體(flexmab)制備dar為1的均相adc。他們將其與使用單馬來酰亞胺pbd二聚體(sg3249)制備的dar為2的位點特異性adc相比，該adc在大鼠中的耐受性是其劑量的兩倍。除以上提到的技術之外，還有基于硒代半胱氨酸的偶聯技術也是有潛力制備dar1的產品的。為了獲得更為高效以及不需基因改造的獲得dar1?adcs，laureen?de?bever等提出了將糖偶聯酶聚糖重塑之后，再基于雙金屬自由點擊反應將一分子的有效載荷偶聯到一分子抗體上，他們發現在相同有效載荷劑量下，dar1?adc與dar2adc相比，觀察到腫瘤球狀體滲透率的顯著改善，強調了較低dar的adc承載超強有效載荷的潛力。
6、以上提到的dar1?adcs的技術雖仍需更充分的研究，但都有證明dar1產品在高活毒素偶聯藥物領域相較于dar2?adcs在藥代和藥效方面可能更有優勢。因此通過簡單工藝制備高質量dar1?adc的工藝是很有必要的。而目前已知的dar1平臺涉及蛋白質工程、連接子有效載荷修飾和/或酶催化，存在抗體表達水平較低、純化復雜和成本較高等缺點。因此，提供一種簡單高效，不需蛋白質工程、連接子有效載荷修飾和/或酶催化，制備均一性得到改善的dar1抗體藥物偶聯物(adc)的新型生物偶聯工藝具有重要的應用價值。
技術實現思路
1、針對現有技術存在的不足，本專利技術的目的在于提供一種dar1抗體藥物偶聯物及其制備方法和應用。本專利技術制備了均一性得到改善的dar1抗體藥物偶聯物，所述藥物通過雙巰基偶聯的反應基團偶聯在抗體上；本專利技術的生物偶聯過程產生的dar1抗體藥物偶聯物(adc)產物的均一性可以得到顯著改善。采用本專利技術的工藝制備的adc中，d1的含量通常超過65wt％，最好超過75wt％，遠好于常規的工藝。
2、為達到此專利技術目的，本專利技術采用以下技術方案：
3、第一方面，本專利技術提供了一種dar1抗體藥物偶聯物，所述藥物連接于巰基反應性載荷上，所述巰基反應性載荷與抗體的fab或鉸鏈結構域的巰基偶聯；所述巰基反應性載荷為與雙巰基偶聯的反應基團；
4、所述藥物為一甲基澳瑞他汀e(mmae)；所述巰基反應性載荷為含有硫橋基團的反應基團。
5、本專利技術的優勢在于雙巰基反應性接頭可以在本專利技術的制備方法下得到dar為1的產品。假設在超強有效載荷的情況下，具有dar<2的adc可能會有非常有益，因為較低的dar可能耐受更高的adc劑量(在相同的有效載荷劑量下)，從而提高組織滲透性。
6、優選地，所述抗體選自：曲妥珠單抗(trastuzumab)、達妥木單抗(daratumumab)或巴利昔單抗(basiliximab)中任意一種。
7、優選地，所述硫橋基團選自：二溴馬來酰亞胺類接頭、4,5-二溴-1,2-二氫噠嗪-3,6-二酮類接頭或雙馬來酰亞胺接頭中任意一種或至少兩種的組合。
8、優選地，所述4,5-二溴-1,2-二氫噠嗪-3,6-二酮類接頭為stb。
9、優選地，所述雙馬來酰亞胺接頭為bismaleimide。
10、優選地，所述二溴馬來酰亞胺類接頭為dbm。
11、第二方面，本專利技術提供一種第一方面所述的dar1抗體藥物偶聯物的制備方法，所述制備方法包括：
12、(s1)在緩沖液體系中將還原劑和過渡金屬離子與抗體孵育，選擇性還原抗體內的鏈間二硫鍵；
13、(s2)采用氧化劑對還原的巰基進行選擇性氧化，氧化反應后采用dippbs淬滅氧化；
14、(s3)將金屬螯合劑、巰基反應性載荷與抗體混合，進行偶聯反應，反應生成dar值為1的偶聯物；
15、(s4)通過純化體系內的小分子雜質，獲得dar1抗體藥物偶聯物。
16、本專利技術的制備工藝繞過了蛋白質工程、酶促反應或額外有效載荷修飾。基于天然鏈間二硫鍵，僅需要在反應中引入微量過渡金屬離子控制氧化還原，從而獲得高均一性的dar1產品。因此，與目前已知的制備dar1?adc的工藝相比，本專利技術的工藝簡單，所得抗體藥物偶聯物的均一性比常規方法有顯著提高。
17、優選地，(s1)中，所述緩沖液體系選自：hepes緩沖液、組氨酸緩沖液、pbs緩沖液或mes緩沖液中任意一種；所述緩沖體系的ph值為5-8，例如可以是5、5.5、6、6.5、7、7.5或8等。
18、優選地，(s1)中，所述還原劑選自：三(2-羧乙基)膦(tcep)、th本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種DAR1抗體藥物偶聯物，其特征在于，所述藥物連接于巰基反應性載荷上，所述巰基反應性載荷與抗體的Fab或鉸鏈結構域的巰基偶聯；所述巰基反應性載荷為與雙巰基偶聯的反應基團；
2.根據權利要求1所述的DAR1抗體藥物偶聯物，其特征在于，所述抗體選自：曲妥珠單抗、達妥木單抗或巴利昔單抗中任意一種；
3.一種權利要求1或2所述的DAR1抗體藥物偶聯物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：
4.根據權利要求3所述的DAR1抗體藥物偶聯物的制備方法，其特征在于，(S1)中，所述緩沖液體系選自：Hepes緩沖液、組氨酸緩沖液、PBS緩沖液或MES緩沖液中任意一種；所述緩沖體系的pH值為5-8；
5.根據權利要求3或4所述的DAR1抗體藥物偶聯物的制備方法，其特征在于，(S1)中，所述孵育的體系中過渡金屬離子與抗體的摩爾比為(0.5-50):1，優選為(1-16):1，進一步優選為(2-8):1；
6.根據權利要求3-5中任一項所述的DAR1抗體藥物偶聯物的制備方法，其特征在于，(S2)中，所述氧化劑選自：過氧化氫、硝酸鹽化合
7.根據權利要求3-6中任一項所述的DAR1抗體藥物偶聯物的制備方法，其特征在于，(S2)中，所述diPPBS與氧化劑的摩爾比為(0.3-4):1；
8.根據權利要求3-7中任一項所述的DAR1抗體藥物偶聯物的制備方法，其特征在于，(S3)中，所述金屬螯合劑選自：EDTA、DPTA或DOTA中任意一種或至少兩種的組合；
9.根據權利要求3-8中任一項所述的DAR1抗體藥物偶聯物的制備方法，其特征在于，(S4)中，所述純化的方法包括過濾、離子交換、超濾或柱層析中的任意一種或至少兩種的組合。
10.權利要求1或2所述的DAR1抗體藥物偶聯物在制備治療腫瘤的藥物制劑中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種dar1抗體藥物偶聯物，其特征在于，所述藥物連接于巰基反應性載荷上，所述巰基反應性載荷與抗體的fab或鉸鏈結構域的巰基偶聯；所述巰基反應性載荷為與雙巰基偶聯的反應基團；
2.根據權利要求1所述的dar1抗體藥物偶聯物，其特征在于，所述抗體選自：曲妥珠單抗、達妥木單抗或巴利昔單抗中任意一種；
3.一種權利要求1或2所述的dar1抗體藥物偶聯物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：
4.根據權利要求3所述的dar1抗體藥物偶聯物的制備方法，其特征在于，(s1)中，所述緩沖液體系選自：hepes緩沖液、組氨酸緩沖液、pbs緩沖液或mes緩沖液中任意一種；所述緩沖體系的ph值為5-8；
5.根據權利要求3或4所述的dar1抗體藥物偶聯物的制備方法，其特征在于，(s1)中，所述孵育的體系中過渡金屬離子與抗體的摩爾比為(0.5-50):1，優選為(1-16):1，進一步優選為(2-8):1；
6.根據權利要求3-5中任一項所述的dar1抗體藥物偶聯物的制備方法，其特征在于，(s2)中，所述氧化劑選...
【專利技術屬性】
技術研發人員：范啟睿，郭雙鳳，張琳，王澤坤，
申請(專利權)人：上海藥明合聯生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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