【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于檢測領域，特別是涉及一種檢測流感病毒h1n1的生物傳感器。
技術介紹
1、核酸儲存著編碼蛋白質的遺傳信息，核酸也是疾病早期診斷和食品安全檢測的重要生物標志物。然而，由于核酸濃度低，往往不能直接檢測。因此，擴增方法對于將核酸含量提高到可檢測水平至關重要。聚合酶鏈反應（pcr）被廣泛認為是擴增和檢測病原微生物核酸的金標準。然而，pcr需要昂貴的熱循環儀器和訓練有素的專業人員。為了克服這一限制，已經開發了幾種等溫擴增技術作為pcr的替代品，這些技術需要恒溫而不是重復的熱循環，從而消除了對昂貴且笨重的熱循環儀器的需求，并且避免了pcr所需的復雜擴增步驟，例如高溫變性，退火和延伸。在過去的二十年中，核酸擴增的等溫方法已經發展成為檢測病原微生物的pcr替代方法，如重組聚合酶擴增（rpa），環介導等溫擴增（lamp）和解旋酶依賴性擴增。ganguli等人開發了一種逆轉錄lamp等溫檢測方法，用于檢測嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒；lim等人構建了一種基于逆轉錄lamp的即時檢驗（poc）裝置，用于同時檢測四種呼吸道病毒（sars?cov-2、甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒）；ahamed等人利用rpa技術建立了crispr?-?cas12a輔助納米孔，用于猴痘病毒的檢測。然而，現有的rpa技術需要多種酶來進行核酸的等溫擴增，如輔助蛋白、單鏈（ss）結合蛋白和鏈置換聚合酶，導致了檢測過程繁瑣。因此，現有的等溫擴增技術在臨床診斷中的應用受到局限。所以，有必要開發一種新型的等溫擴增方法來解決上述困境。
2、由于甲型流感病毒
技術實現思路
1、本專利技術提供了一種流感病毒h1n1側流分析生物傳感器（下文簡稱spa-lfa）解決了現有技術中等溫擴增技術的局限性，也解決了現有技術中檢測h1n1病毒流程較為復雜的問題。
2、一種流感病毒h1n1側流分析生物傳感器，所述生物傳感器使用spa等溫擴增的方法進行檢測，所述生物傳感器包括：引物primer-9、模板template-9、bst?dna聚合酶、dntps、pbs緩沖液、fam?probe和lfa試紙條。
3、優選地，所述primer-9的序列為tctcttatt。
4、優選地，所述template-9的序列為aataagagaaataagaga-3invdt。
5、優選地，所述fam?probe的序列為5fam-gacaagaccaatcct。
6、優選地，所述bst?dna聚合酶為4?u。
7、優選地，所述dntps為dttp與utp-biotin按照終濃度比為1:1混合制備的。
8、優選地，所述pbs緩沖液的ph為7。
9、上述生物傳感器在制備檢測判斷流感病毒h1n1的產品中的應用，所述應用方法包括如下步驟：
10、s1:反應體系為35?μl，其包括2?μl?5?μm的dntps、10?μl?600?nm的primer-9、10?μl?300?nm的template-9、2?μl?4?u的bst?dna聚合酶、5?μl?pbs緩沖液和6?μl無酶水，混合均勻后55?℃反應1-4?h，然后80?℃滅活酶，獲得spa產物；
11、s2:將2?μl?fam-probe、5?μl?spa產物和28?μl?pbs緩沖液混合為35?μl的反應體系，在反應體系中加入待檢測樣品，37?℃孵育10?min，獲得混合物；
12、s3：將混合物滴加到lfa試紙條并加入25?μl?pbs，然后觀察，若control和test處均出現紅線則待檢測樣品為陽性，反之則為陰性。
13、優選地，所述fam-probe的濃度為1.5?μm。
14、優選地，所述待檢測樣品的檢出限為18?pm。
15、有益效果
16、本專利技術建立了一種通過spa-lfa檢測h1n1病毒的方法。引物的延伸擴增是由核苷酸序列的特殊設計實現的。與普通的等溫擴增技術需要多個引物和多種酶相比，本專利技術的檢測方法只需要一個引物和模板就可以獲得較高的擴增效率。并且本研究將建立的spa等溫擴增法與lfa試紙條相結合，lfa試紙條的質控線(c)和檢測線(t)在室溫下肉眼即可觀察紅色條狀信號，因此本專利技術提供的檢測方法更為簡便、直觀，可以便攜式和快速的檢測h1n1病毒，具有poc診斷和臨床分析的巨大潛力。
17、本專利技術提供的一種流感病毒h1n1側流分析生物傳感器，spa產物ssdna可預先制備，直接同待測樣本rna和相關探針進行檢測，不需要復雜的分離步驟或調節溫度程序。從收集樣品到獲得最終結果的時間不到1小時。值得注意的是，從孵育到使用簡單的設備獲得結果只需要10分鐘，而定量pcr則需要1?~?2小時，因此本專利技術提供的方法更簡便、快速。
18、通過使用本專利技術提供的一種流感病毒h1n1側流分析生物傳感器，檢測加標后的臨床血清和唾液樣本，以及檢測感染h1n1病毒的雞胚尿囊液（模擬臨床樣本中的h1n1病毒），結果均與酶聯免疫吸附試驗（elisa）結果一致，證明該生物傳感器具有實際應用能力和較高的準確性。
19、本專利技術提供的一種流感病毒h1n1側流分析生物傳感器具有較高靈敏度，其所建立的spa方法擴增效率較高、反應的孵育時間較短，可以有效地減少目標rna的降解，從而提高了生物傳感器的靈敏度。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種流感病毒H1N1側流分析生物傳感器，其特征在于，所述生物傳感器使用SPA等溫擴增的方法進行檢測，所述生物傳感器包括：引物Primer-9、模板Template-9、Bst?DNA聚合酶、dNTPs、PBS緩沖液、FAM?Probe和LFA試紙條。
2.根據權利要求1所述生物傳感器，其特征在于，所述Primer-9的序列為TCTCTTATT。
3.根據權利要求1所述生物傳感器，其特征在于，所述Template-9的序列為AATAAGAGAAATAAGAGA-3InvdT。
4.根據權利要求1所述生物傳感器，其特征在于，所述FAM?Probe的序列為5FAM-GACAAGACCAATCCT。
5.根據權利要求1所述生物傳感器，其特征在于，所述Bst?DNA聚合酶為4?U。
6.根據權利要求1所述生物傳感器，其特征在于，所述dNTPs為dTTP與UTP-Biotin按照終濃度比為1:1混合制備的。
7.根據權利要求1所述生物傳感器，其特征在于，所述PBS緩沖液的pH為7。
8.權利要求1-7任一
9.根據權利要求8所述應用，其特征在于，所述FAM-Probe的濃度為1.5?μM。
10.根據權利要求8所述應用，其特征在于，所述待檢測樣品的檢出限為18?pM。
...【技術特征摘要】
1.一種流感病毒h1n1側流分析生物傳感器，其特征在于，所述生物傳感器使用spa等溫擴增的方法進行檢測，所述生物傳感器包括：引物primer-9、模板template-9、bst?dna聚合酶、dntps、pbs緩沖液、fam?probe和lfa試紙條。
2.根據權利要求1所述生物傳感器，其特征在于，所述primer-9的序列為tctcttatt。
3.根據權利要求1所述生物傳感器，其特征在于，所述template-9的序列為aataagagaaataagaga-3invdt。
4.根據權利要求1所述生物傳感器，其特征在于，所述fam?probe的序列為5fam-gacaagaccaatcct。
【專利技術屬性】
技術研發人員：卜勝君，龐春穎，王偉陽，代增浩，劉莉君，
申請(專利權)人：長春理工大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。