【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學技術和動物基因工程領域，具體而言，涉及一種新型冠狀病毒動物感染模型的構建方法和應用。
技術介紹
1、目前新型冠狀病毒在全球肆虐，造成全球數以萬計人的感染和死亡，嚴重危害人們生命安全，且由于sars-cov-2作為rna病毒的特點，毒株變異速度快，已經出現了許多sars-cov-2變異株，例如新型冠狀病毒變異株omicron，起相較于原始的wh株，其免疫逃逸嚴重，目前有限應用于治療sars-cov-2的藥物和疫苗對其效果大大減弱，這對篩選和評估新型冠狀病毒sars-cov-2治療藥物，抗體和疫苗提出了急切的需求。同時，新型冠狀病毒sars-cov-2的操作要在生物安全三級實驗室(biosafety?level?3laboratory,bsl-3)里進行，這也大大增加了藥物篩選的難度和成本。目前報道了一些可以在生物安全二級實驗室(biosafety?level?2laboratory，bsl-2)操作的新型冠狀病毒sars-cov-2復制子系統，但對于新型冠狀病毒sars-cov-2的感染和發病機制，篩選有效藥物，抗體和疫苗，不僅需要在細胞水平上進行實驗，也需要在理想的動物模型上來進行大量的體內試驗。小鼠是應用最為廣泛的生物模型之一，但考慮到小鼠與人類在生理、病理等諸多方面存在差異，構建具有人類功能性基因、細胞或組織的人源化小鼠模型尤為重要。利用基因修飾的方法，將目的基因“放置”在小鼠染色體上所制備的轉基因動物模型，是進行一些人類疾病研究的方法。據報道，目前還沒有應用于bsl-2實驗室的新型冠狀病毒sars-
2、因此，急需開發一種能在bsl-2實驗室中方便操作的sars-cov-2復制子及其相關的動物模型。
3、鑒于此，特提出本專利技術。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供了一種新型冠狀病毒動物感染模型的構建方法和應用。
2、本專利技術是這樣實現的：
3、第一方面，本專利技術實施例提供了一種病毒復制子，其包括：新型冠狀病毒sars-cov-2的n基因由報告基因取代的新型冠狀病毒sars-cov-2基因組序列，所述報告基因包括nanoluc報告基因和gfp雙報告基因。
4、第二方面，本專利技術實施例提供了一種dna分子，其包括：能拯救前述實施例所述的病毒復制子的核苷酸序列。
5、第三方面，本專利技術實施例提供了一種病毒復制子系統，其包括：穩定表達新型冠狀病毒sars-cov-2n蛋白的細胞和含前述實施例所述病毒復制子或前述實施例所述的dna分子的表達載體。
6、第四方面，本專利技術實施例提供了病毒復制子的生產方法，其包括：培養前述實施例所述的穩定表達新型冠狀病毒sars-cov-2n蛋白的細胞。
7、第五方面，本專利技術實施例提供了前述實施例所述的病毒復制子或前述實施例所述的dna分子或前述實施例所述的病毒復制子系統或前述實施例所述的生產方法生成的病毒復制子在抗新型冠狀病毒sars-cov-2的藥物篩選中的應用。
8、第六方面，本專利技術實施例提供了一種dna片段，其包括：啟動子、loxp-stop-loxp、sars-cov-2n?cds、wpre和poly-a基因；所述sars-cov-2n?cds的核苷酸序列如seq?id?no:3所示。
9、第七方面，本專利技術實施例提供了一種載體，其含有前述實施例所述的dna片段。
10、第八方面，本專利技術實施例提供了一種動物模型的構建方法，其包括：將cas9蛋白或cas9?mrna、針對tigre位點設計獲得的sgrna以及前述實施例所述的載體注射至受精卵的細胞質或細胞核中，移植入代孕動物母體中，篩選中靶動物，作為f0代，所述構建方法還包括：將f0代動物與背景動物交配，獲得f1代。
11、第九方面，本專利技術實施例提供了如前述實施例所述的動物模型的構建方法構建獲得的動物模型在篩選抗新型冠狀病毒sars-cov-2的藥物中的應用。
12、本專利技術具有以下有益效果：
13、本專利技術提供的病毒復制子，只在特定的穩定表達新型冠狀病毒sars-cov-2n蛋白的細胞中完成多輪復制，而在其他細胞中則不能復制，其生物安全風險大大降低，是一種能在bsl-2實驗室里能操作的系統；在構建該復制子時加入了優化后的雙報告基因，該雙報告基因在基因組上的穩定性強和信號表達強度高，便于對復制子后續應用的觀察和檢測。
14、本專利技術的復制子系統可以在穩定表達n蛋白的細胞上完成復制并包裝出病毒樣顆粒，并在該細胞上進行多輪感染，此種策略大大降低了生物安全風險，使得此系統可以在bsl-2實驗室操作。
15、本專利技術提供的動物模型構建方法具有基因編輯效率高，整合位點及拷貝數明確的特點，解決了現有技術中傳統的隨機轉基因小鼠基因整合位置及拷貝數不固定的問題。該模型能夠被sars-cov-2感染，可用于開發covid-19預防性、治療性藥物的研究。
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1.一種病毒復制子，其特征在于，其包括：新型冠狀病毒SARS-Cov-2的N基因由報告基因取代的新型冠狀病毒SARS-Cov-2基因組序列，所述報告基因包括Nanoluc報告基因和GFP雙報告基因；
2.一種DNA分子，其特征在于，其包括：能拯救權利要求1所述的病毒復制子的核苷酸序列；
3.一種病毒復制子系統，其特征在于，其包括：穩定表達新型冠狀病毒SARS-CoV-2N蛋白的細胞和含權利要求1所述病毒復制子或權利要求2所述的DNA分子的表達載體。
4.根據權利要求3所述的病毒復制子系統，其特征在于，所述表達載體位于所述細胞中；
5.病毒復制子的生產方法，其特征在于，其包括：培養權利要求3或4中所述的穩定表達新型冠狀病毒SARS-CoV-2N蛋白的細胞；
6.權利要求1所述的病毒復制子或權利要求2所述的DNA分子或權利要求3或4所述的病毒復制子系統或權利要求5所述的生產方法生成的病毒復制子在抗新型冠狀病毒SARS-Cov-2的藥物篩選中的應用。
7.一種DNA片段，其特征在于，其包括：啟動子、loxP-Sto
8.一種載體，其特征在于，其含有權利要求7所述的DNA片段；
9.一種動物模型的構建方法，其特征在于，其包括：將Cas9蛋白或Cas9?mRNA、針對Tigre位點設計獲得的sgRNA以及權利要求8所述的載體注射至受精卵的細胞質或細胞核中，移植入代孕動物母體中，篩選中靶動物，作為F0代；
10.如權利要求9所述的動物模型的構建方法構建獲得的動物模型在篩選抗新型冠狀病毒SARS-Cov-2的藥物中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種病毒復制子，其特征在于，其包括：新型冠狀病毒sars-cov-2的n基因由報告基因取代的新型冠狀病毒sars-cov-2基因組序列，所述報告基因包括nanoluc報告基因和gfp雙報告基因；
2.一種dna分子，其特征在于，其包括：能拯救權利要求1所述的病毒復制子的核苷酸序列；
3.一種病毒復制子系統，其特征在于，其包括：穩定表達新型冠狀病毒sars-cov-2n蛋白的細胞和含權利要求1所述病毒復制子或權利要求2所述的dna分子的表達載體。
4.根據權利要求3所述的病毒復制子系統，其特征在于，所述表達載體位于所述細胞中；
5.病毒復制子的生產方法，其特征在于，其包括：培養權利要求3或4中所述的穩定表達新型冠狀病毒sars-cov-2n蛋白的細胞；
6.權利要求1所述的病毒復制子或權利要求2所述的dna分子或權利要求3...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳宇，高翔，梁娟，周立，厲玉婷，吳正中，琚存祥，李穎健，
申請(專利權)人：江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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