【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學領域，具體涉及一種rsv分子的mrna制備及分離純化的方法。
技術介紹
1、mrna技術是將含有編碼抗原蛋白的mrna導入人體，直接進行翻譯，形成相應的蛋白，從而達到相應的免疫預防或者治療的作用。在新冠疫苗研發的進程中，充分體現出了mrna技術研發周期短，生產成本低等優勢。并且隨著了解的深入，mrna技術在蛋白替代療法以及細胞治療等領域的優勢也逐漸顯露出來，其未來產業化應用場景非常多元化。
2、作為一項較新的技術，mrna產業在國內快速發展。mrna工藝過程中的mrna體外轉錄，包括酶加帽法以及共轉錄加帽法。其中酶加帽法工藝過程相對復雜，共轉錄加帽法有工藝簡單，產率高等優勢。mrna工藝過程中的純化工藝，業內常用的包括切向流過濾(tff)，反相，離子，親和層析以及分子篩。其中反相層析載量低，且需引入有毒溶劑；離子交換，親和層析以及分子篩應用較為廣泛，但載量相對低，普適應不高。
3、因此，提供一種高效，穩定，并且能夠高質量產品的mrna制備工藝，成為目前亟待解決的問題。
技術實現思路
1、針對現有技術的不足，本專利技術的第一方面，提供了一種基于rsv分子的mrna體外轉錄體系，所述轉錄體系，包括轉錄反應中各組分含量比例以及對反應過程的控制。
2、本專利技術的第二方面，提供了一種mrna純化工藝，所述純化工藝，包括疏水層析方式及切向流過濾組合。本發提供的mrna工業化純化方案，采用更經濟的疏水填料，可獲得高質量mrna，操作簡
3、本專利技術的第三方面，根據第一方面所述的mrna體外轉錄體系及第二方面所述的mrna純化工藝，在制備mrna疫苗及藥物中的應用。
4、為實現上述專利技術目的，采用以下技術方案：
5、一種mrna體外轉錄(ivt)體系，轉錄所述的核苷酸序列，如seq?id?no.1所示，具有70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％同一性的氨基酸序列。轉錄所述的優化核苷酸序列，如seq?id?no.2所示，具有70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％同一性的氨基酸序列。
6、seq?id?no.1
7、atggaactgctgattctgaaagcgaacgcgattaccaccattctgacc
8、gcggtgaccttttgctttgcgagcggccagaacattaccgaagaattt
9、tatcagagcacctgcagcgcggtgagcaaaggctatctgagcgcgct
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【技術保護點】
1.一種RSV分子的體外轉錄方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述10XTranscription?Buffer包括400-500mM?pH6-8?Tris-HCl，400-500Mm?Mg(CH3COO)2或400-500Mm?MgCl2，10-30mM亞精胺，50-150mM?DTT。
3.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述T7酶的工作濃度為5-12.5KU/ml，無機焦磷酸酶的工作濃度為1-3U/ml，RNA抑制劑的工作濃度為0.5-2KU/ml，ATP，GTP，CTP，N1-Me-pUTP的工作濃度為4-12.5mM，Cap1的作濃度為2-12.5mM。
4.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，投入Dnase?I的終濃度為50-300U/ml。
5.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述10XTranscription?Buffer包括500mM?pH?7.5Tris-HCL，400mM?Mg(CH3COO)2,20mM亞精胺，100mM
6.根據權利要求1-5任一所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述純化工藝包括疏水層析以及切向流過濾。
7.根據權利要求6所述的體外轉錄方法，其特征在于，在所述疏水層析之前還包括對所述IVT反應液進行預處理的操作。
8.根據權利要求7所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述疏水層析采用的介質的配基為丁基或者苯基。
9.根據權利要求8所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述疏水層析采用的層析清洗液為注射水。
10.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述反應器包括攪拌式反應器或wave類反應器。
...【技術特征摘要】
1.一種rsv分子的體外轉錄方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述10xtranscription?buffer包括400-500mm?ph6-8?tris-hcl，400-500mm?mg(ch3coo)2或400-500mm?mgcl2，10-30mm亞精胺，50-150mm?dtt。
3.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述t7酶的工作濃度為5-12.5ku/ml，無機焦磷酸酶的工作濃度為1-3u/ml，rna抑制劑的工作濃度為0.5-2ku/ml，atp，gtp，ctp，n1-me-putp的工作濃度為4-12.5mm，cap1的作濃度為2-12.5mm。
4.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，投入dnase?i的終濃度為50-300u/ml。
5.根據權利要求1所述的體外轉錄方法，其特征在于，所述10xtranscription?buffer包括500mm?ph?7.5tris-hcl，400mm?mg(ch3coo)2,20mm亞精胺，100mm?dtt，所述t7酶的工作濃度為10ku/ml，無機焦磷酸酶的工作濃度為2u/ml，rna抑制劑的工作濃度為1ku/ml，所述所述...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李琴，劉強，胡榮寬，向晟楠，鄭志濤，孫濤，
申請(專利權)人：星銳醫藥蘇州有限公司，
類型：發明
國別省市：
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