【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物分子分析，具體涉及一種基于血清n-聚糖表達的鑒別預測方法。
技術介紹
1、糖基化是一種重要且復雜的蛋白質翻譯后修飾類型，基于糖基化進行生物學標記物的探索或藥物靶點研發等工作目前已被廣泛開展。血清是常見且易獲得的生物樣本，研究血清蛋白質異常糖基化具備診斷疾病、評估預后等重要潛力。當前，針對肺腺癌患者血清蛋白異常糖基化的研究及臨床應用已取得一定進展，一些特定類型糖蛋白被證明在晚期肺腺癌中異常表達并參與了腫瘤進展，但相關領域研究仍相對匱乏且局限。具體表現在：首先，用于鑒定和驗證肺腺癌異常糖基化的糖蛋白組學手段缺乏一致性，不同研究使用的方法存在差異，這增加了結果的不確定性。其次，當前的研究大多聚焦于已經確診肺腺癌的患者，忽略了良性肺結節到肺癌的轉變，因此無法準確體現異常糖基化對于癌癥早期篩查的應用價值。此外，血清中其他因素(如感染、炎癥等)可能影響肺腺癌糖基化標志物的準確性和可靠性，導致漏診或誤診，這說明實驗結果需要更大規模的樣本來進行驗證。
2、因此，有必要基于固相化學酶手段富集血清n-聚糖并進行聚糖表達豐度分析，據此構建一種可用于肺腺癌早期篩查和鑒別診斷的新型預測模型。
技術實現思路
1、本專利技術目的是提供一種基于血清n-聚糖表達的鑒別預測方法，以解決上述問題。
2、本專利技術的一種技術方案是：
3、一種基于血清n-聚糖表達的鑒別預測方法，包括步驟：
4、(1)收集血清樣本，提取血清樣本中的蛋白，獲得血清蛋白溶液；p>
5、(2)將所述蛋白與醛基化的固相樹脂相偶聯；
6、(3)通過乙酸乙酯酯化和碳二亞胺偶聯對聚糖末端的唾液酸進行保護修飾；
7、(4)使用pngase?f切割獲得固相樹脂所連蛋白上的n-聚糖；
8、(5)使用maldi-tof-ms進行血清n-聚糖結構表達模式的分析，計算不同質/荷比聚糖峰的峰下面積與內標dp7的峰下面積的比值，獲取不同結構n-聚糖的相對表達豐度；
9、(6)構建a.ng算法，通過計算上調的n-聚糖與下調的n-聚糖相對豐度的比值auc，以評估血清樣本。
10、進一步的，在步驟(2)中，所述將所述蛋白與醛基化的固相樹脂相偶聯具體為：取固相樹脂于離心管中，使用蛋白質結合緩沖液洗滌所述固相樹脂，加入所述血清蛋白溶液，再向所述離心管中加入去離子水和蛋白結合緩沖液，并在恒溫混勻儀中反應；再加入氰基硼氫化鈉，繼續在所述恒溫混勻儀中反應；洗滌所述固相樹脂。
11、進一步的，所述恒溫混勻儀的溫度為25℃，轉速為1200rpm。
12、進一步的，所述洗滌所述固相樹脂具體為：使用pbs溶液清洗所述固相樹脂，向所述固相樹脂中加入pbs緩沖液和氰基硼氫化鈉，繼續反應；使用tris-hcl溶液清洗所述固相樹脂，向所述固相樹脂中加入tris-hcl溶液和氰基硼氫化鈉，并在室溫下反應，使用氯化鈉溶液和去離子水洗滌所述固相樹脂。
13、進一步的，在步驟(3)中，所述通過乙酸乙酯酯化和碳二亞胺偶聯對聚糖末端的唾液酸進行保護修飾具體為：使用無水乙醇洗滌所述固相樹脂，加入edc-hcl溶液和hobt溶液并渦旋混勻，隨后將混勻的溶液繼續反應；分別使用甲酸溶液、乙腈溶液、氯化鈉溶液和去離子水洗滌所述固相樹脂；使用鹽酸配制對甲苯胺溶液，將所述對甲苯胺溶液與edc溶液和濃鹽酸混合均勻，獲得對甲苯胺和edc混合溶液；隨后向所述固相樹脂中加入所述對甲苯胺和edc混合溶液，混勻，室溫孵育；使用氯化鈉溶液和去離子水洗滌所述固相樹脂。
14、進一步的，所述甲酸溶液的濃度為10％，乙腈溶液的濃度為10％，濃鹽酸的濃度為37％。
15、進一步的，在步驟(4)中，所述使用pngase?f切割獲得固相樹脂所連蛋白上的n-聚糖具體為：向所述固相樹脂中加入碳酸氫銨溶液和pngase?f，混勻，反應得到n-聚糖溶液；離心收集含有n-聚糖的溶液，使用乙腈清洗固相樹脂，并離心收集，與在先收集的n-聚糖溶液混合。
16、進一步的，在步驟(5)中，所述使用maldi-tof-ms進行血清n-聚糖結構表達模式的分析，計算不同質/荷比聚糖峰的峰下面積與內標dp7的峰下面積的比值，獲取不同結構n-聚糖的相對表達豐度具體為：將肽校準標準溶液、dp7溶液和所述n-聚糖溶液滴在maldi靶板表面，在室溫下靜置，直至樣本完全干燥結晶；將dhb基質滴于覆蓋有已干燥的肽校準標準溶液和n-聚糖樣本結晶表面；設置maldi-tof-ms質譜儀器參數；將maldi靶板放入所述maldi-tof-ms質譜儀器中，通過肽校準標準品對所述maldi-tof-ms質譜儀器進行校準，校準結束后測試所述n-聚糖樣本；在獲取maldi質譜數據后，使用flexanalysis軟件分析獲取n-聚糖表達譜圖，計算各質/荷比聚糖峰的峰下面積與內標dp7的峰下面積的比值作為其相對表達豐度，使用glycoworkbench軟件注釋各質/荷比的n-聚糖結構和組成。
17、進一步的，在步驟(6)中，所述構建a.ng算法，通過計算上調的n-聚糖與下調的n-聚糖相對豐度的比值auc，以評估血清樣本具體為：鑒定肺癌血清蛋白中7種上調的n-聚糖和9種下調的n-聚糖；使用7種上調的n-聚糖和9種下調的n-聚糖的峰面積計算正常對照組、良性肺結節患者、早期肺腺癌術前患者和晚期肺腺癌患者的a.ng評分；分別構建健康對照組和良性肺結節患者、健康對照組和早期肺腺癌術前患者、健康對照組和晚期肺腺癌患者、良性肺結節和早期肺腺癌術前患者、早期肺腺癌術前和晚期肺腺癌患者五組a.ng評分的受試者工作特征曲線；計算血清樣本的a.ng算法評分，并依據得分判斷該血清樣本的來源患者是否患有肺腺癌以及肺癌分期。
18、進一步的，當a.ng≤0.272為健康人群；當0.272＜a.ng≤0.326為良性肺結節或早期肺腺癌患者；當0.326＜a.ng≤0.539為早期肺腺癌患者；當a.ng＞0.539為晚期肺腺癌患者。
19、本專利技術提供了一種基于血清n-聚糖表達的鑒別預測方法，其優點在于：
20、(1)利用此方法富集分析聚糖，結果穩定，可重復性好，同時可反應每個患者的個體化差異，在未來具有精準個體化治療的潛力；
21、(2)該方法利用糖基化表達模式構建的a.ng算法可以作為早區分期良惡性肺癌的有效標記物，幫助實現對早期肺癌的敏感、快速和準確的診斷，便于肺癌的早期診斷，對治療和預后至關重要；
22、(3)該方法的肺癌患者的糖基化表達模式可能與疾病預后相關，a.ng算法通過對血清聚糖的定量和分析，具備實現對患者的預后評估和治療反應監測的潛力。
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1.一種基于血清N-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于，包括步驟：
2.根據權利要求1所述的一種基于血清N-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述將所述蛋白與醛基化的固相樹脂相偶聯具體為：取固相樹脂于離心管中，使用蛋白質結合緩沖液洗滌所述固相樹脂，加入所述血清蛋白溶液，再向所述離心管中加入去離子水和蛋白結合緩沖液，并在恒溫混勻儀中反應；再加入氰基硼氫化鈉，繼續在所述恒溫混勻儀中反應；洗滌所述固相樹脂。
3.根據權利要求2所述的一種基于血清N-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于：所述恒溫混勻儀的溫度為25℃，轉速為1200rpm。
4.根據權利要求2所述的一種基于血清N-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于，所述洗滌所述固相樹脂具體為：使用PBS溶液清洗所述固相樹脂，向所述固相樹脂中加入PBS緩沖液和氰基硼氫化鈉，繼續反應；使用Tris-HCl溶液清洗所述固相樹脂，向所述固相樹脂中加入Tris-HCl溶液和氰基硼氫化鈉，并在室溫下反應，使用氯化鈉溶液和去離子水洗滌所述固相樹脂。
5.根據權利要求1所述的一種基于血清N-
6.根據權利要求5所述的一種基于血清N-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于：所述甲酸溶液的濃度為10％，乙腈溶液的濃度為10％，濃鹽酸的濃度為37％。
7.根據權利要求1所述的一種基于血清N-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述使用PNGase?F切割獲得固相樹脂所連蛋白上的N-聚糖具體為：向所述固相樹脂中加入碳酸氫銨溶液和PNGase?F，混勻，反應得到N-聚糖溶液；離心收集含有N-聚糖的溶液，使用乙腈清洗固相樹脂，并離心收集，與在先收集的N-聚糖溶液混合。
8.根據權利要求1所述的一種基于血清N-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于，在步驟(5)中，所述使用MALDI-TOF-MS進行血清N-聚糖結構表達模式的分析，計算不同質/荷比聚糖峰的峰下面積與內標DP7的峰下面積的比值，獲取不同結構N-聚糖的相對表達豐度具體為：將肽校準標準溶液、DP7溶液和所述N-聚糖溶液滴在MALDI靶板表面，在室溫下靜置，直至樣本完全干燥結晶；將DHB基質滴于覆蓋有已干燥的肽校準標準溶液和N-聚糖樣本結晶表面；設置MALDI-TOF-MS質譜儀器參數；將MALDI靶板放入所述MALDI-TOF-MS質譜儀器中，通過肽校準標準品對所述MALDI-TOF-MS質譜儀器進行校準，校準結束后測試所述N-聚糖樣本；在獲取MALDI質譜數據后，使用FlexAnalysis軟件分析獲取N-聚糖表達譜圖，計算各質/荷比聚糖峰的峰下面積與內標DP7的峰下面積的比值作為其相對表達豐度，使用GlycoWorkbench軟件注釋各質/荷比的N-聚糖結構和組成。
9.根據權利要求1所述的一種基于血清N-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于，在步驟(6)中，所述構建A.NG算法，通過計算上調的N-聚糖與下調的N-聚糖相對豐度的比值AUC，以評估血清樣本具體為：鑒定肺癌血清蛋白中7種上調的N-聚糖和9種下調的N-聚糖；使用7種上調的N-聚糖和9種下調的N-聚糖的峰面積計算正常對照組、良性肺結節患者、早期肺腺癌術前患者和晚期肺腺癌患者的A.NG評分；分別構建健康對照組和良性肺結節患者、健康對照組和早期肺腺癌術前患者、健康對照組和晚期肺腺癌患者、良性肺結節和早期肺腺癌術前患者、早期肺腺癌術前和晚期肺腺癌患者五組A.NG評分的受試者工作特征曲線；計算血清樣本的A.NG算法評分，并依據得分判斷該血清樣本的來源患者是否患有肺腺癌以及肺癌分期。
10.根據權利要求9所述的一種基于血清N-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于：當A.NG≤0.272為健康人群；當0.272＜A.NG≤0.326為良性肺結節或早期肺腺癌患者；當0.326＜A.NG≤0.539為早期肺腺癌患者；當A.NG＞0.539為晚期肺腺癌患者。
...【技術特征摘要】
1.一種基于血清n-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于，包括步驟：
2.根據權利要求1所述的一種基于血清n-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述將所述蛋白與醛基化的固相樹脂相偶聯具體為：取固相樹脂于離心管中，使用蛋白質結合緩沖液洗滌所述固相樹脂，加入所述血清蛋白溶液，再向所述離心管中加入去離子水和蛋白結合緩沖液，并在恒溫混勻儀中反應；再加入氰基硼氫化鈉，繼續在所述恒溫混勻儀中反應；洗滌所述固相樹脂。
3.根據權利要求2所述的一種基于血清n-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于：所述恒溫混勻儀的溫度為25℃，轉速為1200rpm。
4.根據權利要求2所述的一種基于血清n-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于，所述洗滌所述固相樹脂具體為：使用pbs溶液清洗所述固相樹脂，向所述固相樹脂中加入pbs緩沖液和氰基硼氫化鈉，繼續反應；使用tris-hcl溶液清洗所述固相樹脂，向所述固相樹脂中加入tris-hcl溶液和氰基硼氫化鈉，并在室溫下反應，使用氯化鈉溶液和去離子水洗滌所述固相樹脂。
5.根據權利要求1所述的一種基于血清n-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述通過乙酸乙酯酯化和碳二亞胺偶聯對聚糖末端的唾液酸進行保護修飾具體為：使用無水乙醇洗滌所述固相樹脂，加入edc-hcl溶液和hobt溶液并渦旋混勻，隨后將混勻的溶液繼續反應；分別使用甲酸溶液、乙腈溶液、氯化鈉溶液和去離子水洗滌所述固相樹脂；使用鹽酸配制對甲苯胺溶液，將所述對甲苯胺溶液與edc溶液和濃鹽酸混合均勻，獲得對甲苯胺和edc混合溶液；隨后向所述固相樹脂中加入所述對甲苯胺和edc混合溶液，混勻，室溫孵育；使用氯化鈉溶液和去離子水洗滌所述固相樹脂。
6.根據權利要求5所述的一種基于血清n-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于：所述甲酸溶液的濃度為10％，乙腈溶液的濃度為10％，濃鹽酸的濃度為37％。
7.根據權利要求1所述的一種基于血清n-聚糖表達的鑒別預測方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述使用pngase?f切割獲得固相樹脂所連蛋白上的n-聚糖具體為：向所述固相樹脂中加入碳酸氫銨溶液和pngase?f，混勻，反應得到n-聚糖溶液；離心收集含有n...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊霜，葛威，
申請(專利權)人：蘇州思萃臨床藥理技術研究所有限公司，
類型：發明
國別省市：
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