【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于酶工程領域，特別涉及具有脂肪酶活性的多肽及其編碼基因，包含所述編碼基因的載體和宿主細胞，以及多肽的制備方法和應用。
技術介紹
1、脂肪酶(triacylglycerol?lipase，e.c.3.1.1.3)，又稱三酰甘油酯水解酶，能夠催化甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯、其它小分子酯、多元醇酯和多元酸酯酯鍵的水解，同時它還能催化酯的酸解、醇解、氨解以及轉酯化和酯合成等反應。脂肪為脂肪酶的天然底物，水解的過程中會產生甘油二酯和甘油單酯，水解最終產物為甘油和脂肪酸。脂肪多為疏水物質，因此水解反應發生在油水界面或者有機相中。脂肪酶催化具有水解條件溫和，不需要輔酶，能耗低，副產物少，環境友好等特點，因此在油脂加工、醫藥、飼料添加劑和化學工業等領域中均展現出了巨大的市場前景。
2、在工業生產過程中，酶制劑往往會經歷高溫環境，而天然脂肪酶在高溫下易失活這一缺點致使工業生產的成本大幅度升高，限制了脂肪酶在工業中的應用。而在尋找熱穩定性較好的脂肪酶的時候，由于可突變的位點多且蛋白結構的復雜性，需要既兼顧熱穩定性又要具有較好的酶活性。則獲得熱穩定性且酶活較高的脂肪酶突變體對于工業應用具有重要價值。因此，本專利技術通過對已有脂肪酶進行改造以使其成為一種熱穩定性及酶活均較高的脂肪酶。
技術實現思路
1、本專利技術的目的之一在于提供一種熱穩定性提高的脂肪酶突變體，且該脂肪酶突變體還具有很好的酶活力。
2、本專利技術具體通過以下技術方案實現：一種脂肪酶突變體，該突變體由如
3、具體的，所述的脂肪酶突變體由脂肪酶氨基酸序列seq?id?no.1中第206位的苯丙氨酸(f)變為半胱氨酸(c)以及第226位的蘇氨酸(t)變為半胱氨酸(c)而獲得。
4、本專利技術所述的脂肪酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
5、本專利技術的另一目的在于提供所述熱穩定性提高的脂肪酶突變體的編碼基因。
6、具體的，編碼上述脂肪酶突變體的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，或為該序列的反向互補序列。
7、所述脂肪酶突變體的酶促反應最適溫度為50℃；且該脂肪酶突變體在60℃耐受70min相對酶活在65％以上、70℃時耐受45min相對酶活在45％左右。
8、在本專利技術的另一方面，所述脂肪酶突變體的氨基酸序列seq?id?no.2經修飾、缺失或添加一或幾個氨基酸獲得的多肽，且與seq?id?no.2所示序列具有90％同源性的序列也在本專利技術的保護范圍內。
9、另一方面，與所述的編碼基因seq?id?no.3編碼相同的蛋白質的核苷酸序列或其互補序列也在本專利技術的保護范圍內。
10、本專利技術的另一目的在于還提供了一種含有脂肪酶突變體編碼基因的表達盒以及含有上述脂肪酶突變體編碼基因的重組表達載體。具體的，所述表達載體為真核表達載體或原核表達載體。更具體的，所述表達載體包括pgapzα、ppic9k或ppiczα。優選的，所述重組表達載體為ppic9k。
11、本專利技術的另一目的在于還提供了一種含有脂肪酶突變體編碼基因的重組工程菌株。具體的，所述宿主細胞為大腸桿菌、畢赤酵母或釀酒酵母。
12、本專利技術的又一目的在于還提供所述熱穩定性提高的脂肪酶突變體的應用，包括酯類的合成、水解、醇解或轉酯化反應。
13、本專利技術的又一目的在于還提供了一種脂肪酶突變體的制備方法，其是將上述重組工程菌進行表達、純化，即得。
14、本專利技術的又一目的在于還提供了一種制備酯類的方法，其是使用上述脂肪酶突變體或其固定化酶，催化脂肪酸與甘油發生酯化反應。
15、本專利技術以現有技術中已獲得的熱穩定性及酶活力均較高的脂肪酶為基礎，所述脂肪酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。先對其進行結構分析，確定該脂肪酶的3d分子結構模型及影響脂肪酶熱穩定性和酶活力的潛在氨基酸殘基，進一步采用突變方式獲得脂肪酶突變體，并結合熱穩定性、酶活力實驗進行篩選，最終獲得目的脂肪酶突變體。
16、與現有技術相比，本專利技術具有如下有益效果：
17、相對于起始脂肪酶(野生型)，該突變體具有更好的熱穩定性和酶活力。在相同條件下，獲得的脂肪酶突變體f206c-t226c在60℃耐受70min、70℃時耐受30min殘活都在65％以上，而野生型脂肪酶在60℃耐受70min、70℃時耐受30min殘活都在50％以下。可見，本專利技術所獲酶突變體的熱穩定性顯著提高；且酶活力也相對起始脂肪酶提高2倍以上。
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1.一種脂肪酶突變體，其特征在于，所述脂肪酶突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.一種多核苷酸分子，其特征在于，其為編碼權利要求1所述脂肪酶突變體的核苷酸序列或其互補序列。
3.如權利要求2所述的多核苷酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。
4.含權利要求2或3所述多核苷酸分子的表達盒或重組表達載體。
5.如權利要求4所述重組表達載體，其特征在于，所述載體為pGAPZα、pPIC9K或pPICZα。
6.含權利要求1所述脂肪酶突變體、權利要求2或3所述的多核苷酸分子或權利要求4所述表達盒或重組表達載體的宿主細胞。
7.如權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌或酵母。
8.一種脂肪酶突變體的制備方法，其特征在于，包括將權利要求6或7所述的宿主細胞進行表達、純化。
9.一種制備油酯的方法，其特征在于，使用如權利要求1所述脂肪酶突變體催化脂肪酸與甘油發生酯化反應。
10.權利要求1所述脂肪酶突變體在酯類的合成、水解、醇
...【技術特征摘要】
1.一種脂肪酶突變體，其特征在于，所述脂肪酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
2.一種多核苷酸分子，其特征在于，其為編碼權利要求1所述脂肪酶突變體的核苷酸序列或其互補序列。
3.如權利要求2所述的多核苷酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
4.含權利要求2或3所述多核苷酸分子的表達盒或重組表達載體。
5.如權利要求4所述重組表達載體，其特征在于，所述載體為pgapzα、ppic9k或ppiczα。
6.含...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李祥英，王江英，陳偉南，
申請(專利權)人：廣東博創佳禾科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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