【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及細(xì)胞培養(yǎng)，尤其涉及一種蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型的構(gòu)建方法。
技術(shù)介紹
1、除人類和哺乳動(dòng)物外，蛋雞脂肪肝出血綜合征發(fā)病率高達(dá)30％，患病蛋雞常伴有肥胖、產(chǎn)蛋率降低、腹部或皮下脂肪堆積，甚至內(nèi)出血導(dǎo)致死亡等情況，對家禽業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。為了探究脂肪肝的分子機(jī)制，并減少其發(fā)病率和死亡率，迫切需要建立合適的代表性模型以進(jìn)行后續(xù)研究。
2、目前肝臟類器官有三種類型的細(xì)胞來源，包括干細(xì)胞、癌細(xì)胞系和原代細(xì)胞。來自原發(fā)性肝癌細(xì)胞的類器官表現(xiàn)出類似于體內(nèi)癌癥的組織學(xué)形態(tài)，大多數(shù)癌細(xì)胞系可攜帶基因異常，主要用于模擬原發(fā)性肝癌和結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移。由于肝原代細(xì)胞不需要廣泛的重編程和分化，對于快速和高通量的藥理學(xué)研究更加方便和經(jīng)濟(jì)。與干細(xì)胞和癌細(xì)胞系來源的類器官相比，原代肝細(xì)胞來源的類器官保留了更多與供體肝臟相同的功能，其基因中攜帶的堿基替換比誘導(dǎo)多能干細(xì)胞少10倍，同時(shí)還保留了供體特異性的特征。研究表明，原代肝細(xì)胞來源的器官組織在藥物代謝和毒性測試中表現(xiàn)出更高的生理相關(guān)性，不僅在基因表達(dá)譜上更接近原始肝臟組織，而且具有更復(fù)雜的肝臟功能，如膽汁合成和脂質(zhì)代謝等。這使它們成為研究肝臟疾病和開發(fā)新藥的重要工具。
3、近年來，研究人員已經(jīng)建立了一些體外模型，能夠充分再現(xiàn)肝臟的特性。傳統(tǒng)的二維肝細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)較為簡單且具有成本效益，可用于探究細(xì)胞分子機(jī)制以及藥物療效，但二維細(xì)胞通常難以再現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和生理特性。傳統(tǒng)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)肝細(xì)胞會(huì)迫使細(xì)胞在培養(yǎng)皿塑料表面上生長，會(huì)影響其重要代謝途徑，導(dǎo)致細(xì)胞骨架變化，并
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，為了解決蛋雞脂質(zhì)沉積模型建立困難的技術(shù)問題，本專利技術(shù)目的是提供一種蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型的構(gòu)建方法，驗(yàn)證了1日齡蛋雞肝臟組織脂質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)功能更加活躍，所分離出的肝臟類器官及肝臟原代細(xì)胞呈現(xiàn)同樣趨勢，肝臟存在脂質(zhì)沉積。因此，選用1日齡蛋雞肝原代細(xì)胞所培養(yǎng)的類器官作為一種天然體外脂質(zhì)沉積模型，通過分離1日齡蛋雞原代肝細(xì)胞，并對類器官接種及培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，成功構(gòu)建了一種原代肝細(xì)胞來源的蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型。
2、為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供的技術(shù)方案是：
3、一種蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
4、(1)取蛋雞肝臟，剔除系膜和膽囊，轉(zhuǎn)移至含2％青鏈霉素的預(yù)冷pbs中，清洗2～3次，直至pbs清澈；
5、(2)將步驟(1)處理獲得的蛋雞肝臟組織置于離心管，加入500μl含2％青鏈霉素的pbs，剪為肝臟組織碎片；
6、(3)將步驟(2)獲得的肝臟組織碎片轉(zhuǎn)入新的離心管中，用含2％青鏈霉素的pbs自然沉降清洗所述肝臟組織碎片2～3次，4℃，700rpm，離心3min，收集肝臟組織碎片；
7、(4)將步驟(3)獲得的肝臟組織碎片轉(zhuǎn)移至含10ml肝解離液的離心管，37℃水浴消化30min，期間每隔10min取出離心管，用力上下?lián)u晃30s；消化結(jié)束后，用力上下?lián)u晃30s，收集帶有肝細(xì)胞的消化液；
8、(5)將步驟(4)收集的帶有肝細(xì)胞的消化液用70μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至新的離心管，4℃，1500rpm，離心5min，收集肝細(xì)胞沉淀，去除消化液；
9、(6)用7ml含1％青鏈霉素的advanced?dmem/f12重懸步驟(5)獲得的肝細(xì)胞沉淀，4℃，1500rpm，離心5min，收集新的肝細(xì)胞沉淀，重復(fù)2～3次直至洗凈，獲得洗凈的肝細(xì)胞；
10、(7)用生長培養(yǎng)基重懸步驟(6)獲得的洗凈的肝細(xì)胞，細(xì)胞懸液濃度約為600,000個(gè)/ml，加入預(yù)冷的基質(zhì)膠充分混合均勻，每孔接種50μl至24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)孔中央；
11、(8)將步驟(7)制備的培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，靜置30min，待基質(zhì)膠凝固后，每孔加入500μl含1％青鏈霉素的hepaticulttm類器官生長培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱；
12、(9)每隔3d對蛋雞肝臟類器官換液，獲得蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型。
13、優(yōu)選的，
14、所述步驟(1)蛋雞肝臟采用1日齡蛋雞肝臟。
15、優(yōu)選的，
16、所述步驟(4)中，肝解離液的組分包括：125μl/ml?collagenase?type?iv(1mg/ml)、125μl/ml?dispase(1u/ml)、750μl/ml?advanced?dmem/f-12、15μl/ml?hepes(1m)和10μl/ml青鏈霉素混合液(100×)。
17、優(yōu)選的，
18、所述步驟(2)中的組織碎片大小為0.5mm3。
19、優(yōu)選的，
20、所述步驟(7)中，所述24孔培養(yǎng)板接種前于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)熱30min。
21、優(yōu)選的，
22、所述步驟(7)中生長培養(yǎng)基和基質(zhì)膠的比例為1:2。
23、優(yōu)選的，
24、所述步驟(7)中蛋雞肝臟類器官的培養(yǎng)數(shù)量為10,000個(gè)/孔。
25、優(yōu)選的，
26、所述步驟(8)中培養(yǎng)箱溫度為37℃，co2含量為5％。
27、本專利技術(shù)的有益效果是：
28、本專利技術(shù)提供的蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型的構(gòu)建方法，含有內(nèi)源脂質(zhì)沉積，具有更高的脂代謝活性，與傳統(tǒng)外源添加脂肪酸的方法相比，降低了研究成本，避免了類器官質(zhì)量下降，為蛋雞脂代謝的研究提供了理想的體外模型，為雞肝臟脂代謝及相關(guān)疾病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型的構(gòu)建方法，其特征在于，
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型的構(gòu)建方法，其特征在于，
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型的構(gòu)建方法，其特征在于，
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8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型的構(gòu)建方法，其特征在于，
【技術(shù)特征摘要】
1.一種蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型的構(gòu)建方法，其特征在于，
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型的構(gòu)建方法，其特征在于，
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋雞肝臟類器官天然脂質(zhì)沉積模型的構(gòu)建方法，其特征在于，
<...【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊小軍，王譯彬，侯起航，劉瑞，劉艷利，
申請(專利權(quán))人：西北農(nóng)林科技大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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