【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及一種產紫色桿菌素的基因工程菌的構建方法和應用。
技術介紹
1、紫色桿菌素(violacein)是某些特殊微生物代謝過程中產生一種天然吲哚衍生物，呈現出漂亮的藍紫色，是一種純粹的天然微生物色素。紫色桿菌素具有多種生物活性如抗腫瘤、抑菌、抗生素潛力、抗真菌、抗藻、抗癌和抗病毒等，其不僅可以單獨發揮抑菌抗菌活性，還可以與其他抗生素協同發揮作用，使抑菌活性倍增，在生物醫藥領域具有極大的應用開發價值；而其獨特的藍紫色，在化妝品、紡織印染等行業也到廣泛應用。
2、但是由于產紫色桿菌素原始菌株通常具有培養條件苛刻、生長緩慢、色素產量不穩定等缺點，使紫色桿菌素的大宗工業化生產受到限制，因此，通過基因工程或合成生物學手段，構建重組菌株提高紫色桿菌素產量的研究備受關注。
3、酵母表達系統可高水平表達蛋白，且具有翻譯后修飾功能，是表達大規模蛋白的有力工具。在表達基因工程產物時，與其他微生物相比，釀酒酵母具有遺傳背景清晰、遺傳操作體系簡單成熟、安全性高、易于大規模培養從而降低生產成本等優點，廣泛用于外源蛋白的表達相關研究。
技術實現思路
1、本專利技術要解決的技術問題是提供一種可產紫色桿菌素的基因工程菌的構建方法及其生物法產紫色桿菌素的應用。
2、為解決上述技術問題，本專利技術提供一種產紫色桿菌素(violacein)的基因工程菌：在釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)中插入紫色桿菌素合成途徑相關基因表達盒并過表達vi
3、即，所述產紫色桿菌素(violacein)的基因工程菌是s.cerevisiae及其同科同屬的菌株中插入紫色桿菌素合成途徑相關基因表達盒并過表達vioc基因所得。
4、說明：構建產紫色桿菌素合成基因簇的底盤微生物不僅限于釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)ysg50，凡是可以表達產紫色桿菌素合成基因簇的所有微生物均可使用。
5、作為本專利技術的產紫色桿菌素(violacein)的基因工程菌的改進：
6、紫色桿菌素合成途徑相關基因表達盒為：
7、vioa基因表達盒(seq?id?no.2)、viob基因表達盒(seq?id?no.3)、vioc基因表達盒(seq?id?no.4)、viod基因表達盒(seq?id?no.5)、vioe基因表達盒(seq?id?no.6)。
8、作為本專利技術的產紫色桿菌素(violacein)的基因工程菌的進一步改進：
9、還包括ura基因表達盒(seq?id?no.1)和vioc過表達基因表達盒(seq?id?no.7)。
10、即，所述紫色桿菌素合成途徑相關基因表達盒的核苷酸序列如seq?id?no.1-seqid?no.7所述。也包括seq?id?no.1-seq?id?no.7的其同源和同功能基因。
11、作為本專利技術的產紫色桿菌素(violacein)的基因工程菌的進一步改進：
12、紫色桿菌素基因簇來源于duganella?sp.中，但不僅限與該菌株，與本菌株中的相似序列可合成紫色桿菌素的基因簇的核苷酸序列。
13、說明：紫色桿菌素基因簇中含有vioa,viob,vioc，viod，vioe存在與duganella?sp中，在此基礎上構建基因表達盒。
14、本專利技術還同時提供了利用上述基因工程菌進行的紫色桿菌素的制備方法，包括以下步驟：
15、將基因工程菌s.cerevisiae?ysg50-vio-vioc+接種至發酵培養基進行發酵培養，收集發酵液，所述發酵液中含有紫色桿菌素。
16、作為本專利技術的紫色桿菌素的制備方法的改進：將發酵液進行分離純化，獲得紫色桿菌素。
17、作為本專利技術的紫色桿菌素的制備方法的進一步改進：發酵培養基中接種量為0.5％～2.5％(體積％)，發酵培養溫度為30～40℃，發酵培養時間為12～48h。
18、作為本專利技術的紫色桿菌素的制備方法的進一步改進：發酵培養基中含有濃度為10g/l～30g/l的葡萄糖。
19、即，發酵培養基以葡萄糖為底物發酵產生紫色桿菌素。
20、作為本專利技術的紫色桿菌素的制備方法的進一步改進：分離純化方法利用旋轉蒸發儀乙醇復溶法，而后通過冷凍干燥法制備獲得紫色桿菌素。
21、本專利技術所述的基因工程菌構建方法是以釀酒酵母為出發菌株，利用釀酒酵母染色體多拷貝位合整合方式敲入紫色桿菌合成途徑相關表達盒，具體敲入過程詳見實施例1。
22、本專利技術的方法獲得的基因工程菌以以葡萄糖為底物，接種量0.5％～2.5％，外源色氨酸的添加量為0g/l～1.6g/l，在30℃～40℃下培養12～60h的條件下發酵可產紫色桿菌素。
23、本專利技術構建的基因工程菌，發酵獲得的代謝物，利用旋轉蒸發儀以及冷凍干燥機，獲得紫色桿菌素粗提物(如圖12)，具體過程詳見實施例2。
24、本專利技術獲得的基因工程菌產物，進一步進行紫色桿菌素組成分析，通過uplc-q/tof-ms定性，采用masslynx?v4.2對正、負離子模式總離子流圖進行處理，結合mass值、保留時間和分子式匹配軟件，用unifiportal軟件進行數據分析，定性檢測紫色桿菌素，具體過程詳見實施例3。
25、本專利技術獲得的基因工程菌在以葡萄糖為底物，接種量0.5％～2.5％，在30℃～40℃下培養12～60h的條件下發酵可產紫色桿菌素0.1～145.28mg/l，即，每l發酵液能制備獲得0.1～145.28mg紫色桿菌素。
26、本專利技術的有益效果主要體現在：目前，通過生物發酵產紫色桿菌素的菌株主要集中在紫色桿菌和紫色杜氏桿菌，而利用釀酒酵母生產紫色桿菌素的研究方法在近年來的報道中很少。除此之外，通過利用δ和rdna多拷貝位點整合紫色桿菌素合成代謝途徑相關基因表達盒生產紫色桿菌素的方法尚未見報道。δ和rdna多拷貝位點整合是效率極高的染色體整合方式且釀酒酵母是最廣泛的真核模式生物。本專利技術的方法為生產者提供了通過生物合成法生產甘露糖的新路徑以及拓寬了研究者對生物合成紫色桿菌素研究的新思路
27、綜上，本專利技術公開了一種通過插入紫色桿菌素合成途徑相關基因表達盒，釀酒酵母產紫色桿菌素(violacein)的方法及其應用。專利技術所述的出發菌株為釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)，產紫色桿菌素的基因工程菌是在釀酒酵母(s.cerevisiae)中插入紫色桿菌素合成途徑相關基因表達盒，其中所述的基因紫色桿菌素合成途徑相關基因表達盒如序列表中seq?id?no.1-seq?id?no.7所示。本專利技術提供的產紫色桿菌素基因工程菌的構建方法獲得基因工程菌，可利用含葡萄糖(glucose)為底物，在發酵過程中可產生紫色桿菌素。
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1.產紫色桿菌素(Violacein)的基因工程菌，其特征在于：在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中插入紫色桿菌素合成途徑相關基因表達盒并過表達vioC基因后，得到產紫色桿菌素(Violacein)的基因工程菌S.cerevisiae?YSG50-vio-vioC+。
2.根據權利要求1所述的產紫色桿菌素(Violacein)的基因工程菌，其特征在于：
3.根據權利要求2所述的產紫色桿菌素(Violacein)的基因工程菌，其特征在于：
4.根據權利要求1～3任一所述的產紫色桿菌素(Violacein)的基因工程菌，其特征在于：
5.利用如權利要求1～4任一所述的基因工程菌進行的紫色桿菌素的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的紫色桿菌素的制備方法，其特征在于：將發酵液進行分離純化，獲得紫色桿菌素。
7.根據權利要求5或6所述的紫色桿菌素的制備方法，其特征在于：
8.根據權利要求7所述的紫色桿菌素的制備方法，其特征在于：
9.根據權利要求
...【技術特征摘要】
1.產紫色桿菌素(violacein)的基因工程菌，其特征在于：在釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)中插入紫色桿菌素合成途徑相關基因表達盒并過表達vioc基因后，得到產紫色桿菌素(violacein)的基因工程菌s.cerevisiae?ysg50-vio-vioc+。
2.根據權利要求1所述的產紫色桿菌素(violacein)的基因工程菌，其特征在于：
3.根據權利要求2所述的產紫色桿菌素(violacein)的基因工程菌，其特征在于：
4.根據權利要求1～3任一所述的產紫色桿菌素(vio...
【專利技術屬性】
技術研發人員：董益恒，陳佳樂，趙洪新，翟梗然，付紅偉，曾國紅，
申請(專利權)人：浙江理工大學，
類型：發明
國別省市：
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