【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于穿山甲類分子生物學研究領域，具體涉及一種中華穿山甲快速無損傷取樣方法。
技術介紹
1、中華穿山甲(manis?pentadactyla)是鱗甲目的胎盤哺乳動物，因其重疊的表皮鱗片、食蟻飲食、缺牙以及異常延長的舌頭而成為最不尋常的哺乳動物之一。它們在生態系統中扮演重要角色，包括作為社會性昆蟲的捕食者、洞穴創造者、內外寄生蟲的宿主，以及其他捕食者的獵物。
2、另一方面，由于穿山甲可作為奢侈品美食、且其鱗片可用于于傳統醫藥，因此穿山甲被大量捕殺和利用，現存的八種穿山甲都經歷了嚴重的種群下降。其中，中華穿山甲是最受威脅的物種之一。同時，在國際自然保護聯盟(iucn)紅色名錄中其已被列為極度瀕危物種。實驗室對中華穿山甲的分子研究，必不可少的要提取中華穿山甲的基因組dna，而傳統的穿山甲取樣方法大多是抽取穿山甲的血液進行dna提取，近來，也有學者運用皮膚/鱗片進行改良實驗，但仍然會對穿山甲造成潛在的損害。通過糞便提取dna同樣是一種非侵入性的方法，但它的dna提取效率較低，且易受環境因素的影響。
3、目前現有的從動物(包括人)口腔中利用粘液、粘膜提取dna的方法例如有申請號為201210554081.0的專利技術《適用于多種樣本的dna提取試劑配制方法和提取方法》、201610097433.2的專利技術《棘胸蛙快速無損傷取樣方法》。
4、201610097433.2的專利技術《棘胸蛙快速無損傷取樣方法》告知：運用自制的滅菌塑料膜棉簽，對棘胸蛙口腔內細胞進行取樣，將取出的口腔細胞放入離心管，加
5、但是，采用上述方法提取中華穿山甲dna效果不佳。
技術實現思路
1、本專利技術要解決的技術問題是提供一種中華穿山甲快速無損傷取樣的方法，以實現快速、無損傷的提取中華穿山甲基因組dna。
2、為了解決上述技術問題，本專利技術提供一種中華穿山甲快速無損傷取樣方法(快速、無損傷提取中華穿山甲dna的簡易方法)：根據中華穿山甲口腔內壁上的口腔唾液，提取dna。
3、作為本專利技術的中華穿山甲快速無損傷取樣方法的改進，依次包括如下步驟：
4、1)、利用滅菌后的頂部帶有棉簽(棉花頭)的一次性拭子刮取中華穿山甲口腔內壁上的口腔唾液(含口腔上皮細胞)；
5、2)、將黏取了中華穿山甲口腔唾液的一次性拭子作為樣本，放入裝有dna保存液的離心管(1.5ml離心管)中，所述dna保存液的高度至少沒過一次性拭子的頂部棉簽；
6、3)、利用步驟2)所得物提取樣本dna，可采用試劑盒takara?minibest?universalgenomic?dna?extraction?kit?ver.5.0提取。
7、作為本專利技術的中華穿山甲快速無損傷取樣方法的進一步改進，所述步驟3)依次包括以下步驟：
8、3.1)、向步驟2)所得的離心管(即，收集了口腔上皮細胞的離心管)中加入180±10μl的buffer?gl、20±1μl的proteinase?k和10±0.5μl的rnase?a(10mg/ml)，充分混合(用震蕩儀震蕩約1min從而確保與收集的口腔上皮細胞充分混合)，棄棉簽；
9、然后，于56±1℃恒溫水浴2～3h(使口腔上皮細胞完全裂解)，得裂解產物；
10、3.2)、向步驟3.1)所得裂解產物中加入20±1μl?rnase?a(10mg/ml)，室溫放置2～5min；
11、3.3)、向步驟3.2)所得物中加入200±10μl的buffer?gb和200±10μl乙醇(純乙醇)，混合(輕輕混合避免基因組dna斷裂)；
12、3.4)、將spin?column安置于collection?tube上，組成柱式集合管；
13、將步驟3.3)所得物全部加入柱式集合管中，靜置1.5～2.5min；然后將柱式集合管離心1～2min，棄濾液；
14、3.5)、向步驟3.4)所得的柱式集合管中加入500±10μl的buffer?wa(確保在加入buffer?wa之前完全清空之前的濾液)；然后離心1～2min，棄濾液；
15、3.6)、向步驟3.5)所得的柱式集合管中沿spin?column管壁四周加入700±10μl的buffer?wb乙醇液；然后離心1～2min，棄濾液；
16、所述buffer?wb乙醇液的制備方法為：每24ml的buffer?wb加入56ml的純乙醇；
17、3.7)、直接取步驟3.6)所得的柱式集合管內的spin?column進行如下的步驟3.8)；
18、或者，將步驟3.6)所得的柱式集合管再按照步驟3.6)重復操作1～2次；而后取步驟3.7)所得的柱式集合管內的spin?column進行如下的步驟3.8)；
19、說明：重復操作目的是為了提高dna的獲得量；
20、3.8)、取出柱式集合管內的spin?column，將其安置于離心管(新的1.5ml的離心管)上；向spin?column膜的中央處加入50～200μl(較佳為50μl)的elution?buffer，而后打開吸附柱的蓋子后于室溫靜置4～6min(目的是將spin?column徹底干燥，以防止殘留的乙醇影響后續步驟)；
21、3.9)、將步驟3.8)所得的柱式集合管離心1～2min；離心所得的液體為提取的dna。
22、說明：該dna立即可進行下一步實驗，也可-4℃短時間保存或-20℃長期保存。
23、作為本專利技術的中華穿山甲快速無損傷取樣方法的進一步改進：所述dna保存液由三羥甲基氨基甲烷(tris)、乙二胺四乙酸(edta)、疊氮鈉(作為防腐劑)和去離子水組成；所述dna保存液中：tris的濃度為(10±1)mm，edta的濃度為(1±0.1)mm，疊氮鈉的濃度為0.025～0.035％(質量％，優選0.03％)。
24、作為本專利技術的中華穿山甲快速無損傷取樣方法的進一步改進：
25、所述步驟3.8)中：所述elution?buffer為事先已加熱至65±5℃的elutionbuffer。
26、即，提前將elution?buffer加熱至65±5℃，而后再加入至spin?column膜的中央，目的是為了有利于提高洗脫效率。
27、作為本專利技術的中華穿山甲快速無損傷取樣方法的進一步改進：離心的轉速為(12,000±1000)rpm。
28、本專利技術的上述所有步驟中，沒有明確告知溫度的，均在室溫下進行。
29、本專利技術的步驟中所接觸中華穿山甲dna的器具，均經過高溫滅菌。
30、本專利技術中所使用的蛋白酶k(proteinase?k)、核糖核酸酶a(rnase?a)、包括各種洗滌緩沖液等(buffer?gl、buf本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.中華穿山甲快速無損傷取樣方法，其特征在于：根據中華穿山甲口腔內壁上的口腔唾液，提取DNA。
2.根據權利要求1所述的中華穿山甲快速無損傷取樣方法，其特征在于依次包括如下步驟：
3.根據權利要求2所述的中華穿山甲快速無損傷取樣方法，其特征在于所述步驟3)依次包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的中華穿山甲快速無損傷取樣方法，其特征在于：
5.根據權利要求4所述的中華穿山甲快速無損傷取樣方法，其特征在于：
6.根據權利要求2～5任一所述的中華穿山甲快速無損傷取樣方法，其特征在于：離心的轉速為(12,000±1000)rpm。
【技術特征摘要】
1.中華穿山甲快速無損傷取樣方法，其特征在于：根據中華穿山甲口腔內壁上的口腔唾液，提取dna。
2.根據權利要求1所述的中華穿山甲快速無損傷取樣方法，其特征在于依次包括如下步驟：
3.根據權利要求2所述的中華穿山甲快速無損傷取樣方法，其特征在于所述步驟3)依次包括以下步驟...
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭榮泉，黃昊宸，王志剛，張鑫昊，沈臻輝，
申請(專利權)人：浙江師范大學，
類型：發明
國別省市：
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