【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于免疫分析，具體而言，涉及一種明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法在腫瘤診斷和免疫微環境中的運用。
技術介紹
1、明視場光鏡顯色技術，不同于暗視野熒光顯微鏡下的多色信號顯示，其原理是通過依次疊加原始信號最后軟件合成形成的多色顯示。目前，明視場光鏡下只能夠原位實現雙色（紅色和黃色）雙標記或雙色（紅色和黃色）三標記，該標記技術在前列腺癌p63/p504s或p63/34βe12/p504s等方面已多見報道。但是其運用有限，目前只能提供一至兩種不同顏色的免疫組織化學顯示信號，相對單一，無法做出全面的病理診斷。主要原因是無法實現更多的腫瘤及環境生物標志物的展示。另外，目前也尚未有關于3色或多色信號的免疫組織化學的光鏡顯示技術的文獻報道，其中一方面的原因可能技術上確實存在難點，再者“減法原理”導致的信號變化的瓶頸無法突破。
技術實現思路
1、本專利技術的首要目的是提供一種明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，以能夠實現只需通過光學顯微鏡用裸眼觀察的腫瘤原位多色顯示，而無需軟件進行合成的目的。
2、為此，本專利技術提供如下技術方案。
3、本專利技術的一個方面提供了一種明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，包括對待測組織樣本依次采用黃色、紅色、綠色，或者黃色、紫色、青藍色的顏色組合進行顯色的步驟；所述待測組織樣本包括腫瘤淋巴三級結構、浸潤淋巴細胞、尿路上皮癌細胞、非小細胞肺癌、前列腺癌。
4、作為本專利技術的一個優選實施例，所述方法包括以下步驟
5、s1：對待測石蠟組織進行切片、脫蠟以及水洗，獲得待測組織切片；
6、s2：對待測組織切片進行抗原修復，獲得修復后的待測組織切片；
7、s3：對修復后的待測組織切片進行以下（1）或（2）的顏色組合方式進行染色顯色，獲得染色后的組織切片：
8、（1）黃色、紅色、綠色；
9、（2）黃色、紫色、青藍色；
10、s4：對所得染色后的組織切片進行襯染，襯染結束后將組織切片脫水、封片，獲得襯染后的組織切片；
11、s5：將襯染后的組織切片顯微鏡觀察，獲得顯色結果。
12、作為本專利技術的一個優選實施例，步驟s2中，所述抗原修復采用edta-tris?ph9.0。
13、作為本專利技術的一個優選實施例，步驟s2中，所述抗原修復條件為：97~100℃水浴下煮20~30min，或者121℃、1.21kpa下噴氣2~2.5min。
14、作為本專利技術的一個優選實施例，步驟s3中，所述染色顯色步驟具體包括：
15、（i）將修復后的待測組織切片依次進行第一抗體、第二抗體孵育，然后采用顯黃色染料進行顯色，獲得顯黃色組織切片；
16、（ii）將所得顯黃色組織切片依次進行第三抗體、第二抗體孵育，然后采用顯紅色或紫色染料進行顯色，顯色結束后用酸浸泡組織切片，獲得同時顯黃色和紅色，或黃色和紫色組織切片；
17、（iii）將所得同時顯黃色和紅色，或黃色和紫色組織切片依次進行第四抗體、第五抗體孵育，然后采用顯綠色或青藍色染料進行顯色，顯色結束后，獲得同時顯黃色、紅色和綠色，或黃色、紫色和青藍色組織切片。
18、作為本專利技術的一個優選實施例，所述第一抗體選自鼠抗人單克隆抗體ki67或其他細胞核定位抗體；
19、所述第二抗體包括hpr-多聚復合物二抗envision；
20、所述第三抗體選自鼠抗人單克隆抗體ck或其他細胞質定位抗體；
21、所述第四抗體選自鼠抗人單克隆抗體pd-l1或其他細胞膜定位抗體；
22、所述第五抗體包括ap-多聚復合物二抗或hpr-多聚復合物二抗envision。
23、作為本專利技術的一個優選實施例，步驟（i）中，所述顯黃色染料包括dab。
24、作為本專利技術的一個優選實施例，步驟（ii）中，所述顯紅色染料包括hrp-magenta。
25、作為本專利技術的一個優選實施例，步驟（ii）中，所述顯紫色染料包括purple?紫色源。
26、作為本專利技術的一個優選實施例，步驟（ii）中，所述酸選自硫酸、鹽酸或者醋酸中的任一種。
27、作為本專利技術的一個優選實施例，步驟（iii）中，所述顯綠色染料包括staygreen、vinagreen。
28、作為本專利技術的一個優選實施例，步驟（iii）中，所述顯青藍色染料包括teal青藍。
29、作為本專利技術的一個優選實施例，步驟（iii）中，顯色結束后采用二甲亞砜浸泡組織切片。
30、作為本專利技術的一個優選實施例，步驟s4中，所述襯染采用的染料包括蘇木素、核固紅。
31、借由上述技術方案，本專利技術至少具有下列優點：
32、1、本專利技術通過對待測組織樣本依次進行黃色、紅色、綠色以及藍色染色，或者黃色、紫色、青藍色以及紅色染色兩種顯色方式進行染色顯色，所提供的兩種顏色組合的染色方式是在原方法雙色的基礎上增加了等于或大于3個顏色信號顯示。本專利技術所提供的四種顏色組合和特定的染色順序均為人眼較為敏感的觀察顏色組合，容易被人眼在明視場下觀察并捕捉顏色對比的程度，并且無視覺色差的干擾，保證了結果只需通過光學顯微鏡用裸眼觀察的腫瘤原位多色顯示，而無需軟件進行合成。另外，按照免疫組織化學的評判標準來講，本專利技術的染色方法不僅容易定性，也容易對信號含量進行“定量”評估。
33、2、在本專利技術的免疫組織化學多色顯示技術中，所用綠顏色免疫組化用途底物包括但不限于堿性磷酸酶的底物（staygreen），辣根過氧化物酶底物（vinagreen）均生成具有組織學明確定位的綠色信號，且綠顏色信號醒目；所用紅色免疫組化用途底物包括但不限于hrp酶（magenta紅色底物）和ap堿性磷酸酶底物（fastred、permanentred），該底物在對應酶作用下，生成顏色愉悅的紅粉色，很容易被觀察者敏銳的觀察到。本專利技術所用兩種信號穩定，不易被有機溶劑分解而導致信號受損。在普遍臨床實踐中，經過數十次測試，二十多位病理專家的判讀，普遍反饋顏色信號好看（比單純的dab黃~棕黃），結果被采納通過。
34、3、本專利技術還通過采用酸（包括但不限于0.3m硫酸）作為hrp-magenta紅色信號的分化液；采用dmso（二甲基亞砜）作為staygreen綠色信號的分化液，克服了兩種或多種顏色產生的“減法原理”導致原信號的衰減或變化的缺陷，從而保證了一張切片上同一視野中的信號分布的客觀性和正確性。
35、4、本專利技術的免疫組織化學多色顯示技術適用于人體或動物源來源的標本，包括不限于福爾馬林固定的病理腫塊、炎性組織、細胞涂片、胸腹水等。適合所有的臨床免疫組織化學染色全自動平臺。例如，本專利技術的方法可實現對腫瘤微環境的判讀，包括腫瘤淋巴三級結構（tls）、浸潤淋巴細胞（tils）；也可實現精準伴隨診斷，包括但不限于pd-l1?cd23?cd8等。
36、上述本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在于，包括對待測組織樣本依次采用黃色、紅色、綠色，或者黃色、紫色、青藍色的顏色組合進行顯色的步驟；
2.根據權利要求1所述的明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在于，步驟S2中，所述抗原修復采用EDTA-Tris?pH9.0。
4.根據權利要求2所述的明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在于，步驟S2中，所述抗原修復條件為：97~100℃水浴下煮20~30min，或者121℃、1.21Kpa下噴氣2~2.5min。
5.根據權利要求2所述的明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在于，步驟S3中，所述染色顯色步驟具體包括：
6.根據權利要求5所述的明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在于，所述第一抗體選自鼠抗人單克隆抗體Ki67或其他細胞核定位抗體；
7.根據權利要求5所述的明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在
8.根據權利要求5所述的明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在于，步驟（ii）中，所述顯紅色染料包括HRP-Magenta；
9.根據權利要求5所述的明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在于，步驟（iii）中，所述顯綠色染料包括Staygreen、Vinagreen；
10.根據權利要求2所述的明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在于，步驟S4中，所述襯染采用的染料包括蘇木素、核固紅。
...【技術特征摘要】
1.一種明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在于，包括對待測組織樣本依次采用黃色、紅色、綠色，或者黃色、紫色、青藍色的顏色組合進行顯色的步驟；
2.根據權利要求1所述的明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在于，步驟s2中，所述抗原修復采用edta-tris?ph9.0。
4.根據權利要求2所述的明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在于，步驟s2中，所述抗原修復條件為：97~100℃水浴下煮20~30min，或者121℃、1.21kpa下噴氣2~2.5min。
5.根據權利要求2所述的明視場顯微鏡下免疫組織化學多色顯示方法，其特征在于，步驟s3中，所述染色顯色步驟具...
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