【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學診斷領域，具體涉及用于sma基因突變的檢測試劑盒。
技術介紹
1、脊肌萎縮癥(spinal?muscular?atrophy，sma)是兒童最常見的常染色體隱性遺傳性神經肌肉病，發病率約為1/6000～1/10,000。sma以脊髓前角運動神經元退化變性導致的肌無力和肌萎縮為主要臨床特征，病情進展導致骨骼系統、呼吸系統、消化系統及其他系統異常，運動功能嚴重受累，逐步喪失自主生活能力，重癥患者死于呼吸衰竭。根據發病年齡及臨床表現分為ⅰ型(嚴重型)、ⅱ型(中間型)、ⅲ型(輕型)和ⅳ型(成人型)。根據發病年齡、臨床表現及病情進展程度進行臨床診斷，同時可行相關輔助檢查方法包括肌電圖、肌酶和肌肉活檢，結合家族史和smn1基因分析以進行確診。
2、sma相關基因，包括運動神經元存活基因1(survival?motor?neuron,smn1)和運動神經元存活基因2(survival?motor?neuron,smn2)。兩者均定位于一個復雜的倒位片段重復區—5q13區。位于5q13端粒側的smn1基因是sma疾病的致病基因，全長約27kb，包含9個外顯子(1，2a，2b，3～8)。位于著絲粒側的smn2基因是疾病的修飾基因，與smn1基因高度同源，兩者在基因組上的序列同源性高達99.9％。隨著sma在治療、臨床管理和預后評估方面的發展，smn2基因的作用進一步得到了認可。
3、90％-95％的sma患者基因型是smn1雙等位基因外顯子7和/或8純合缺失所致，另外約5％由smn1基因復合雜合變異
4、由于smn1和smn2兩個基因序列高度同源，準確區分兩個基因的序列有一定的挑戰。目前主要有幾種方法都存在一些缺陷：(1)利用rt-pcr結合克隆測序明確smn1基因點變異，但rna樣本相對不穩定，克隆技術檢測范圍有限，操作繁瑣、耗時，故不易實現檢測標準化流程。(2)lr-pcr(long?range?pcr)主要針對e8差異位點設計引物進行smn1基因的特異擴增，再對不同外顯子進行第二次pcr擴增與測序，確認smn1基因點突變的位置。因此，目前該技術的缺陷在于lr-pcr的擴增范圍只局限于smn1和smn2基因28kb范圍，難以明確擴增基因范圍外的序列問題。因此，有必要尋求一種新的smn1和smn2基因變異的檢測方法，同步專一性地擴增兩個基因，簡化操作流程。(3)二代測序(next-generation?sequencing,ngs)和靶向三代測序均需要對smn1和smn2基因進行測序文庫構建，流程比較繁瑣、費用相對較高。
5、lr-pcr技術利用長讀長的優勢，可以直接跨越完整的lr-pcr擴增子并保留相位信息，可以更準確的鑒定兩個同源基因。本專利技術利用該方法使用超長片段擴增的9條引物+gap引物的引物組合，所述引物組合能夠檢測smn1和smn2基因點變異及小插入和缺失、smn1-smn2部分轉化類型的序列變異和基因內結構重組。
技術實現思路
1、本專利技術提供一用于檢測smn1和smn2基因序列變異的引物組及方法，該方法使用超長片段擴增的9條引物+gap引物的引物組合，所述引物組合能夠同時檢測smn1及smn2基因的點變異及小插入和缺失、smn1-smn2部分轉化類型的序列變異和基因內結構重組。
2、具體的，本專利技術涉及一組smn1和smn2基因長片段lr-pcr引物組合，所述引物組合如下：
3、a)擴增涵蓋全長smn1的>31kb基因組片段的引物，包括
4、seq?id?no.1：tcaagtgttctgctcacctcagcctctg，
5、seq?id?no.2：gcatgagtcaccacgcctggttcacaat，
6、seq?id?no.3:tggtgagcgatggtggtaggtaaaacc，
7、以及
8、seq?id?no.4：ccaccgtgctggcctcccacccccacac；
9、b)巢式pcr引物seq?id?no.11-26。
10、另一方面，本專利技術還涉及一組檢測smn1-smn2部分轉化類型的序列變異的lr-pcr引物組合，其特征在于，所述引物組合如下：
11、a)擴增smn1-smn2部分轉化基因型的約27kb基因區段的擴增引物，包括
12、seq?id?no.5:gttgggggatcaaatatcttctagtgtt；
13、seq?id?no.6:gctctttattgtgaaagtatgtttcttccacgt；
14、seq?id?no.7:gctctttattgtgaaagtatgtttcttccacgta；
15、以及
16、seq?id?no.8:gtatgtttcttccacataaccaaccagtt；
17、b)巢式pcr引物seq?id?no.11-26。
18、另一方面，本專利技術還涉及一組明確擴增范圍內smn1基因的結構重組的lr-pcr引物組合，其特征在于，所述引物組合如下：
19、a)擴增涵蓋全長smn1的>31kb基因組片段的引物，包括
20、seq?id?no.1：tcaagtgttctgctcacctcagcctctg，
21、seq?id?no.2：gcatgagtcaccacgcctggttcacaat，
22、seq?id?no.3:tggtgagcgatggtggtaggtaaaacc，
23、以及
24、seq?id?no.4：ccaccgtgctggcctcccacccccacac；
25、b)巢式pcr引物seq?id?no.9與seq?id?no.10。
26、另一方面，本專利技術還涉及一組檢測smn2基因序列變異的lr-pcr引物組合，其特征在于，所述引物組合如下：
27、a)擴增涵蓋全長smn2的>31kb基因組片段的引物，包括
28、seq?id?no.1：tcaagtgttctgctcacctcagcctctg，
29、seq?id?no.2：gcatgagtcaccacgcctggttcacaat，
30、seq?id?no.3:tggtgagcgatggtggtaggtaaaacc，
31、以及
【技術保護點】
1.一組檢測SMN1基因序列變異的LR-PCR引物組合，其特征在于，所述引一組檢測SMN1基因序列變異的LR-PCR引物組合，其特征在于，所述引物組合如下：
2.一組檢測SMN1-SMN2部分轉化類型的序列變異的LR-PCR引物組合，其特征在于，所述引物組合如下：
3.一組明確擴增范圍內SMN1基因的結構重組的LR-PCR引物組合，其特征在于，所述引物組合如下：
4.一組檢測SMN2基因序列變異的LR-PCR引物組合，其特征在于，所述引物組合如下：
5.一組SMN1和SMN2基因的巢氏PCR引物組合，其特征在于，所述引物組合如下：
6.一組SMN1和/或SMN2基因長片段LR-PCR引物組合，其特征在于，其包括權利要求1-5的引物組合中的任意兩組、三組或四組的組合。
7.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測試劑盒，組成成分包括AS-LR-PCR反應液、SMN1引物混合液、SMN2引物混合液、DNA聚合酶；所述SMN1和SMN2引物混合液中包含權利要求1-6任意一項的引物組合。
8.根據權利要
9.根據權利要求6-7任意一項的試劑盒，其特征在于，所述增強劑包括甜菜堿、二甲基亞砜、甘油或乙二醇中的一種或多種。
10.根據權利要求6-7任意一項的試劑盒，其特征在于，所述SMN1引物為SEQ?ID?No.1-4、5-8、9-10和/或11-26的引物組合；優選SEQ?IDNo.1-4和11-26，或SEQ?ID?No.5-8和11-26，或SEQ?ID?No.1-4和9-10，所述SMN2引物為SEQ?ID?No.1-3、27和11-26的引物組合。
11.權利要求1-6任意一項引物組合或權利要求7-10任意一項所述的試劑盒在制備脊髓性肌萎縮癥相關基因核酸檢測試劑盒中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一組檢測smn1基因序列變異的lr-pcr引物組合，其特征在于，所述引一組檢測smn1基因序列變異的lr-pcr引物組合，其特征在于，所述引物組合如下：
2.一組檢測smn1-smn2部分轉化類型的序列變異的lr-pcr引物組合，其特征在于，所述引物組合如下：
3.一組明確擴增范圍內smn1基因的結構重組的lr-pcr引物組合，其特征在于，所述引物組合如下：
4.一組檢測smn2基因序列變異的lr-pcr引物組合，其特征在于，所述引物組合如下：
5.一組smn1和smn2基因的巢氏pcr引物組合，其特征在于，所述引物組合如下：
6.一組smn1和/或smn2基因長片段lr-pcr引物組合，其特征在于，其包括權利要求1-5的引物組合中的任意兩組、三組或四組的組合。
7.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測試劑盒，組成成分包括as-lr-pcr反應液、sm...
【專利技術屬性】
技術研發人員：白晉麗，瞿宇晉，宋昉，金煜煒，王紅，
申請(專利權)人：首都兒科研究所，
類型：發明
國別省市：
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