【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因檢測，具體涉及一種皮南牛gdf2基因snp分子標記、檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的引物、試劑盒、檢測方法及其應用。
技術介紹
1、皮南牛是皮埃蒙特牛與南陽牛雜交而形成，含皮埃蒙特牛血統75％，南陽牛血統25％，它保持了南陽牛適應性好，耐粗飼的優點，同時繼承了皮埃蒙特牛生長發育快，瘦肉率高的特點。但在皮南牛新品種培育過程中，仍然存在核心群數量不足，整齊度較低，分子育種技術應用不足等問題。
2、生長分化因子2(growth?differentiation?factor?2，gdf2)是一種由肝星狀細胞特異性分泌的骨形態發生蛋白，是一種強效的促成骨因子，在調節糖脂代謝及造血細胞功能、誘導軟骨細胞分化等方面均具有重要作用。研究發現，gdf2基因作為哺乳動物生長性狀候選基因，其snp研究受到了廣泛關注，并在多物種中得到了可用于后續選育的候選功能性snps。
3、單核苷酸多態性(single?nucleotide?polymorphism，snp)標記是被研究最多、前景最大的一種分子標記。自jordan1994年首次把snp作為一個新的學術名詞在《人類分子遺傳》雜志上提出，很快成為新興的第三代分子標記技術，在家畜分子標記輔助選育中應用越來越廣泛。
4、在畜禽研究中，已發現gdf2的多個snp位點與其體尺性狀會產生顯著影響，但在皮南牛中還未曾有過報道，考慮到gdf2基因的snp變異與皮南牛體尺性狀的關聯分析至關重要，為加速我國皮南牛育種進程，有必要提供一種與皮南牛體尺性狀相關的g
5、目前，snp檢測方法眾多，大約有20多種，可分為2大類。一類是基于凝膠電泳的snp檢測方法，包括單鏈構象多態性(pcr-sscp)、變性梯度凝膠電泳(dgge)、酶切擴增多態性序列(caps)、等位基因特異性pcr(as-pcr)等。另一類是高通量、自動化程度較高的snp檢測方法，包括直接測序、dna芯片、變性高效液相色譜(dhplc、質譜檢測、高分辨熔解曲線(hrm)等。第一類方法產物需要通過瓊脂糖凝膠電泳或者聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定，有時需要用到溴化乙錠核酸指示劑，該指示劑具有致癌性，且在紫外燈下觀察，對檢測人員的身體健康也有一定的影響，另外，有時需要用到限制性內切酶，也比較昂貴；第二類方法操作比較復雜，技術要求高，儀器設備昂貴，這在很大程度上限制了snp檢測分型在普通育種單位的應用。
6、目前，可視化檢測方法主要是應用核酸試紙條檢測技術，而且主要應用到病原菌、病毒和肉食品源成分等方面的快速檢測，且更多關注種間差異基因dna序列差異，應用到單個堿基方面的檢測還很少見。因此，開發一種操作簡單、技術要求低和可視化的snp檢測方法就顯得尤為重要了。
技術實現思路
1、針對目前技術存在的問題，本專利技術提供一種檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp分子標記及分型引物、試劑盒、檢測方法及其應用。
2、本專利技術解決其技術問題所采用的方案是：一種與南牛體尺性狀相關的snp分子標記的檢測方法，包括以下步驟：
3、s1、選取若干皮南牛，分別進行體尺數據測量并編號記錄親緣關系，采集各皮南牛個體靜脈全血，并提取個體基因組dna，并進行濃度和純度檢測，選取合格的dna；
4、s2、選取5個親緣關系遠的皮南牛個體dna進行混合得到一管混池dna模板；
5、s3、設計合成擴增引物對p1，所述擴增引物對的核苷酸序列如seq?id?no.1和2所示；
6、s4、以混池dna為模板，以引物對p1進行pcr擴增反應得到p1引物的pcr擴增產物；s5、對擴增產物進行測序，得到測序基因序列與峰圖；將測序結果進行峰圖對比確定突變位點g.4為c＞t堿基突變。
7、本專利技術還提供一種檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的引物，該檢測引物的序列為：
8、gdf2-4-f-c：gggcgagagcataccaagatgggcc；
9、gdf2-4-f-t：gggcgagagcataccaagatgggtc；
10、gdf2-r：tgcggtggctcggctcgggttctgt。
11、上述的檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的引物，所述引物是根據ncbi數據庫中公布的牛gdf2基因序列genbank?accession?no.nc_037355.1：42263200-42267306所示核苷酸序列設計得到。
12、上述的檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的引物，兩條上游引物的5'末端進行biotin修飾、3’端進行lna修飾；下游引物5’端進行fitc修飾。
13、本專利技術還提供一種檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的試劑盒，該試劑盒包括上述任一項所述的引物。
14、上述的檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的試劑盒，還包括2×marathon?buffer、dntp、marathon?dna聚合酶和ddh2o。
15、本專利技術還提供一種檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的檢測方法，該方法包括以下步驟：
16、(1)取待測樣本，使用gdf2-4-f-c+gdf2-r引物進行pcr擴增反應；同時使用gdf2-4-f-t+gdf2-r引物進行pcr反應；
17、(2)反應結束后，打開pcr反應管，將試紙條的結合墊端插入pcr反應管，待判讀區全部浸潤，將試紙平放1min，等待試紙條顯色，根據試紙條顯色情況判斷結果；所述試紙條顯色情況判定標準為：
18、當gdf2-4-f-t引物為陰性、gdf2-4-f-c引物為陽性時，基因型為cc；
19、當gdf2-4-f-t引物為陽性、gdf2-4-f-c引物為陽性時，基因型為ct；
20、當gdf2-4-f-t引物為陽性、gdf2-4-f-c引物為陰性時，基因型為tt。
21、上述的檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的檢測方法，步驟(1)中的反應體系為：
22、
23、上述的檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的方法，所述待測樣本為牛全血或牛dna。
24、上述的檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的方法，步驟(1)中的反應條件為：94℃預變性3min；98℃變性20s，退火溫度62-74℃，反應時間30s，72℃延伸20s，共29個循環，72℃延長10min，4℃保存。
25、上述的檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的方法，退火溫度為72℃。
26、本專利技術所述的分子標記、檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的標記引物、試劑盒以及所述的檢測方法在皮南牛基因型分型鑒定方面的應用。
27、本專利技術所述的分子標記、檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的標記引物、試劑盒以及所述的檢測方法在鑒定皮南牛體尺性狀中的應用。...
【技術保護點】
1.一種與南牛體尺性狀相關的SNP分子標記的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.一種檢測皮南牛GDF2基因g.4位點SNP的引物，其特征在于：該檢測引物的序列為：GDF2-4-F-C：GGGCGAGAGCATACCAAGATGGGCC；
3.如權利要求2所述的檢測皮南牛GDF2基因g.4位點SNP的引物，其特征在于：兩條上游引物的5'末端進行BIOTIN修飾、3’端進行LNA修飾；下游引物5’端進行FITC修飾。
4.一種檢測皮南牛GDF2基因g.4位點SNP的試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括權利要求2-3任一項所述的引物。
5.如權利要求4所述的檢測皮南牛GDF2基因g.4位點SNP的試劑盒，其特征在于：還包括2×Marathon?Buffer、dNTP、Marathon?DNA聚合酶和ddH2O。
6.一種檢測皮南牛GDF2基因g.4位點SNP的檢測方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：
7.如權利要求6所述的檢測皮南牛GDF2基因g.4位點SNP的檢測方法，其特征在于：步驟(1)中的反應體系為：<...
【技術特征摘要】
1.一種與南牛體尺性狀相關的snp分子標記的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.一種檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的引物，其特征在于：該檢測引物的序列為：gdf2-4-f-c：gggcgagagcataccaagatgggcc；
3.如權利要求2所述的檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的引物，其特征在于：兩條上游引物的5'末端進行biotin修飾、3’端進行lna修飾；下游引物5’端進行fitc修飾。
4.一種檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括權利要求2-3任一項所述的引物。
5.如權利要求4所述的檢測皮南牛gdf2基因g.4位點snp的試劑盒，其特征在于：還包括2×marathon?buffer、dntp、marathon?dna...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張曉建，孫中文，韋光輝，劉世偉，白躍宇，張偉，杜超，馮宇震，馮鈺華，曹燕娜，張昆，沈繼源，郭利亞，
申請(專利權)人：河南科技學院，
類型：發明
國別省市：
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