【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于疫苗試劑提取，尤其涉及一種皂苷佐劑純化方法。
技術介紹
1、皂素佐劑（qs-21）是從皂樹皮(quillaja?saponaria)中提取的一種活性成分,一直作為作為疫苗的優選佐劑，包含qs-21的復合佐劑廣泛用于疫苗開發研究。
2、qs-21能夠引起小鼠特異性抗原-抗體和cd8+?細胞免疫應答，產生igg1和igg2a抗體。相比之下，鋁鹽佐劑主要刺激機體產生igg1抗體。研究表明，qs-21能夠促進細胞毒性t淋巴細胞（ctls）,分泌th1細胞因子，白介素2和γ干擾素以及針對蛋白抗原的igg2a型的抗體。qs-21佐劑在目標抗原刺激抗體應答和t細胞應答方面相比其他類型的佐劑，包括：葡聚糖類佐劑細菌核苷類、細菌脂多糖類佐劑等都有顯著優勢。
3、含qs-21的復合佐劑，如：as01,as-02等，目前已應用于人病毒疫苗的臨床研究，包括：流感疫苗、瘧疾、乙肝、人乳頭瘤、艾滋、肺結核、非小細胞肺癌和黑色素瘤等。
4、中國專利技術cn201880077052.5說明書中記載了一種皂苷提取含有至少qs-21主峰和2018組分的皂樹（quillaja?saponaria?molina）的粗制水性提取物，其中如通過在214?nm的uv吸光度測得的2018組分/qs-21主峰的比率≤0.075，獲得這樣的提取物的方法和相關方面；提到了皂樹樹皮材料樣品在約60-70℃溫度的水性提取2-5小時左右，提取物再用pvpp處理、過濾并濃縮，在加入苯甲酸鈉將ph調節到3.8-5.2左右并滅菌。但這個專利中存
技術實現思路
1、為了解決以上技術問題，本專利技術提供一種皂苷佐劑純化方法，提取簡單、成本低，提取率高，以及純化率高，且不用其它有機溶劑；本專利技術中水提可以把樹皮中qs-21提取90%及以上，經過3步純化后的收率30%及以上。
2、解決以上技術問題的本專利技術的一種皂苷佐劑提取純化方法，包括以下步驟：
3、（1）將樹皮粉碎后加入純化水浸泡樹皮粉；
4、（2）取出上清液離心，得含qs-21佐劑的上清液ⅰ，再用濾器過濾，去除不溶性顆粒得上清液ⅱ；
5、（3）用polar?mc-cm填料對上清液ⅱ進行離子交換層析，得純化液；
6、（4）對純化液進行濃縮換液，得超濾液；濃縮換液降低氯化鈉濃度，以防影響反相層析效果。
7、（5）使用amethyst?c18-h反相色譜介質進行反相粗純，收集洗脫峰，得反相液；amethyst?c18-h粗純中有多個洗脫峰，收集其中一個洗脫峰的一部分信息。
8、（6）使用反相unisil?c8色譜介質進行反相精純，收集洗脫峰，即得高純度qs-21樣品。unisil?c8?精純中有一個洗脫峰，收集全部洗脫峰信息。
9、本專利技術中從樹皮中提取qs-21，qs-21佐劑的純化方法適用于規模化生產，能夠得到均一、純度高的qs-21。
10、本專利技術首先以皂樹樹皮為原料，首先需要將樹皮粉碎成均勻的樹皮細粉，利于提取，再選用離子交換填料捕獲樣品，去除纖維素、多酚、生物堿、單寧等；再進一步選用反相填料粗純去除qs-17、qs-18等皂苷相似物；再進一步選用c8填料精細純化，得到高純度qs-21。
11、優化方案中，使用粉碎機，將大塊樹皮粉碎至粉末狀待用。
12、所述步驟（1）中粉碎為至80%樹皮粉過40-100目藥用篩，優化方案中過50目藥用篩。粒度不同溶出不同，粒度過大無法在規定時間內溶出?90%。
13、優化方案中，所述步驟（1）中以樹皮細粉重量計加入8-12倍的純化水，浸泡0.5-1.5h。
14、進一步優化方案中，所述步驟（1）中以樹皮細粉重量計加入10倍的純化水，浸泡1h。浸泡時間短樣品無法溶出,時間長會浪費工時。粉碎為較小粒度后減少工時。
15、所述步驟（2）中后去取上層清液離心，離心力≥5000g，離心液再使用0.22um濾器過濾去除不溶性顆粒，得到上清液用于離子交換。層析樣品需經?0.22um?濾膜，否則會堵塞層析系統管路，也會對填料造成損害。另外，或不離心后續步驟根本無法進行；離心后不過濾，濃縮無法進行，造成管路堵塞。
16、進一步地優化方案中，所述步驟（3）中離子層析選用的填料孔徑為30、60或80的離子交換填料。
17、所述的離子交換層析具體包括以下步驟：
18、用磷酸緩沖液平衡離子交換柱至基線平穩；將上清液上樣，上樣結束后用含有20mm的磷酸緩沖液再次平衡層析柱至基線平穩；再用400～500mm?nacl的磷酸緩沖液洗脫，收集目的峰，得到純化液。
19、優化方案中，所述步驟（4）中采用5-30kda超濾膜包對純化液進行濃縮換液，換液10次，獲得超濾液。
20、所述步驟（5）中粗純amethyst?c18-h反相層析具體包括：
21、用含有30%乙腈+0.05%tfa的緩沖液平衡反相層析柱至基線平穩，將超濾液上樣至反相層析柱，上樣結束后，用含有95%乙腈+0.05%tfa的緩沖液線性洗脫，收集目的峰，得到反相液；
22、所述步驟（5）中反相粗純中緩沖液的ph為5.0-6.0；所述粗純液a：30%乙腈水溶液+0.05%tfa；b液:95%乙腈水溶液+0.05%tfa，進行線性洗脫，0-50%b。
23、所述步驟（6）中精純中洗脫液:40%乙腈+0.05%tfa。ph為5.0-6.0；洗脫液為amethyst?c18-h洗脫液。
24、所述步驟（6）中精純unisil?c8反相層析包括：
25、用含有30%乙腈+0.05%tfa的緩沖液平衡層析柱至基線平穩，將反相液上樣于c8反相柱，上樣結束后，使用40%乙腈+0.05%tfa洗脫，收集洗脫峰，得到高純度的含qs-21的樣品溶液。
26、用純化水提取細粉主要雜質是纖維素、多酚、生物堿、單寧等，可通過在離子交換結合能力不同而分離。qs-21分子量1990da，在水溶液中形成膠束后分子量可達60-70kda，采用30kda膜包超濾去除部分小分子（可溶性雜質和鹽分）。根據疏水性不同，利用反相層析分離qs-21和其他皂苷。
27、本專利技術中先通過反相層析?amethyst?c18-h填料初分離后，取純度≥50%的收集液合并后用反相層析unisil?c8填料精分離，取純度≥95%的收集液合并，得到高純度樣品。
28、本專利技術中水提可以把樹皮中qs21提取90%及以上，經過3步純化后的收率30%及以上。
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1.一種皂苷佐劑純化方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種皂苷佐劑純化方法，其特征在于：所述步驟（1）中粉碎為至80%樹皮粉過40-100目藥用篩，優化方案中過50目藥用篩。
3.根據權利要求1或2中所述的一種皂苷佐劑純化方法，其特征在于：所述步驟（1）中以樹皮細粉重量計加入8-12倍的純化水，浸泡0.5-1.5h。
4.根據權利要求3所述的一種皂苷佐劑純化方法，其特征在于：所述步驟（1）中以樹皮細粉重量計加入10倍的純化水，浸泡1h。
5.根據權利要求1所述的一種皂苷佐劑純化方法，其特征在于：所述步驟（2）中后去取上層清液離心，離心力≥5000g，離心液再使用0.22um濾器過濾去除不溶性顆粒，得到上清液用于離子交換。
6.根據權利要求1所述的一種皂苷佐劑純化方法，其特征在于：所述步驟（3）中離子層析選用的填料孔徑為30、60或80的離子交換填料。
7.根據權利要求6所述的一種皂苷佐劑純化方法，其特征在于：所述離子交換層析具體包括以下步驟：
8.根據權利要求1所述的一種皂
9.根據權利要求1所述的一種皂苷佐劑純化方法，其特征在于：所述步驟（5）中粗純Amethyst?C18-H反相層析具體包括：
10.根據權利要求1所述的一種皂苷佐劑純化方法，其特征在于：所述步驟（6）中精純UniSil?C8反相層析包括以下步驟：
...【技術特征摘要】
1.一種皂苷佐劑純化方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種皂苷佐劑純化方法，其特征在于：所述步驟（1）中粉碎為至80%樹皮粉過40-100目藥用篩，優化方案中過50目藥用篩。
3.根據權利要求1或2中所述的一種皂苷佐劑純化方法，其特征在于：所述步驟（1）中以樹皮細粉重量計加入8-12倍的純化水，浸泡0.5-1.5h。
4.根據權利要求3所述的一種皂苷佐劑純化方法，其特征在于：所述步驟（1）中以樹皮細粉重量計加入10倍的純化水，浸泡1h。
5.根據權利要求1所述的一種皂苷佐劑純化方法，其特征在于：所述步驟（2）中后去取上層清液離心，離心力≥5000g，離心液再使用0.22um濾器過濾去除不溶性顆粒，得到上清液用于離...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉濤，趙策，秦耀斌，劉環，楊立憲，邢超，王海龍，
申請(專利權)人：北京華諾泰生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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