【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于細(xì)胞膜表面工程化，具體涉及一種增強(qiáng)msc骨靶向能力的dna納米貼片及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、骨質(zhì)疏松癥是由成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收之間的不平衡相互作用引起的，目前的治療方法主要集中于抗骨吸收藥物和促合成代謝藥物上，缺少能夠同時(shí)發(fā)揮多種作用的治療方法。值得注意的是，細(xì)胞外微環(huán)境，包括活性氧（ros）、無機(jī)組分、免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子等，同樣會(huì)顯著影響骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展。最近的研究表明ros骨代謝是有害的，它可以在刺激破骨細(xì)胞分化的同時(shí)抑制成骨分化。因此，新的治療策略必須同時(shí)解決骨重塑和骨質(zhì)疏松微環(huán)境帶來的問題。
2、作為成骨細(xì)胞的前體，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal?stem?cell,?msc)移植可以促進(jìn)成骨分化，可以增強(qiáng)骨礦物質(zhì)密度，減緩骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展。然而，目前的msc療法缺乏靶向能力和微環(huán)境調(diào)節(jié)。專注于基因編輯的工程msc已經(jīng)被開發(fā)出來解決這些問題，但它們也增加了與基因工程相關(guān)的免疫原性反應(yīng)和其他并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。非基因編輯細(xì)胞表面工程賦予msc增強(qiáng)的歸巢、粘附和遷移能力，以及減弱免疫原性和避免遺傳風(fēng)險(xiǎn)。功能化dna因其易于合成和生物相容性而聞名，是這種工程化的理想選擇。框架核酸(framework?nucleicacids,?fnas)，尤其是dna折紙（don），具有優(yōu)越的穩(wěn)定性、可編程性，此外其磷酸鹽骨架可以與骨鈣螯合，使其具有一定的骨靶向能力，但它們?cè)阱^定msc治療骨質(zhì)疏松癥方面的潛力仍未被探索。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為解決上述
2、本專利技術(shù)提供的技術(shù)方案如下：
3、一種增強(qiáng)msc骨靶向能力的dna納米貼片的制備方法，包括以下步驟：將環(huán)狀腳手架鏈和訂書釘鏈混合后得到矩形dna折紙；在骨靶向肽(?dss6)的3'端修飾馬來亞酰胺基團(tuán)，得到馬來亞酰胺基團(tuán)修飾的骨靶向肽，將馬來亞酰胺基團(tuán)修飾的骨靶向肽與5'?-硫醇修飾的短鏈混合，得到骨靶向肽-短鏈；在dna短鏈上修飾膽固醇，得到膽固醇-短鏈；將矩形dna折紙、骨靶向肽-短鏈和膽固醇-短鏈混合，得到增強(qiáng)msc骨靶向能力的dna納米貼片。
4、進(jìn)一步的，矩形dna折紙、骨靶向肽-短鏈和膽固醇-短鏈的摩爾比為1:5~10:10~20。
5、進(jìn)一步的，將矩形dna折紙、骨靶向肽-短鏈和膽固醇-短鏈混合后，將混合物加熱至40~50℃，以0.15~0.25℃/min的速度冷卻至20~30℃，得到增強(qiáng)msc骨靶向能力的dna納米貼片。
6、進(jìn)一步的，所述骨靶向肽-短鏈的制備方法包括：將6-馬來酰亞胺基己酸加入含有o-苯并三唑-n，n，n'和二異丙基乙胺的二甲基甲酰胺溶液中與骨靶向肽反應(yīng)，用三氟乙酸去除肽保護(hù)基團(tuán)，室溫孵育后，純化得到馬來亞酰胺基團(tuán)修飾的骨靶向肽；將馬來亞酰胺基團(tuán)修飾的骨靶向肽與5'?-硫醇修飾的短鏈反應(yīng)生成骨靶向肽-短鏈。
7、進(jìn)一步的，所述膽固醇-短鏈的制備方法包括：將dna短鏈加入含有三氯乙酸的二氯甲烷中，得到脫保護(hù)的dna短鏈；將脫保護(hù)的dna短鏈加入5-膽固醇ce與四氮唑的混合物中，得到中間體；將中間體加入在含有乙酸酐和1-甲基咪唑的乙腈溶液中，然后用碘氧化，得到膽固醇-短鏈。
8、本專利技術(shù)提供一種dna納米貼片，由上述制備方法制備而成。
9、本專利技術(shù)還提供上述的dna納米貼片在制備骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。
10、進(jìn)一步的，所述骨質(zhì)疏松藥物的制備方法包括：將上述的dna納米貼片錨定于間充質(zhì)干細(xì)胞的表面，得到dna納米貼片-間充質(zhì)干細(xì)胞，并采用dna納米貼片-間充質(zhì)干細(xì)胞制備得到骨質(zhì)疏松藥物。
11、進(jìn)一步的，所述dna納米貼片-間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法包括：將上述的dna納米貼片添加至間充質(zhì)干細(xì)胞懸液中使dna納米貼片終濃度為4~6?nm，振蕩金屬浴孵育后，使dna納米貼片錨定于間充質(zhì)干細(xì)胞的表面，得到dna納米貼片-間充質(zhì)干細(xì)胞。
12、進(jìn)一步的，所述骨質(zhì)疏松藥物用于提高絕經(jīng)后小鼠骨密度及改善體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。
13、有益效果
14、矩形dna折紙（rdon）和骨靶向肽(dss6）的雙重靶向作用，經(jīng)靜脈注射后具有治療潛力的msc選擇性地在骨組織中積累，直接發(fā)揮增加骨量的作用。矩形dna折紙作為ros清除劑，可以通過減輕骨質(zhì)疏松微環(huán)境中的氧化應(yīng)激來不僅可以促成骨分化，還可以抑制破骨細(xì)胞的形成。
15、dna納米貼片（dnp，也可以縮寫為d/chrdon）是由rdon衍生而來，通過在rdon上裝載膽固醇（ch）和骨靶向肽（dss6）合成而成。通過膽固醇的疏水作用將dnp錨定于msc細(xì)胞膜上，形成dnp工程化msc（dnp-msc）。經(jīng)靜脈注射后，這些工程化的msc基于dnp的骨靶向特性的驅(qū)動(dòng)下優(yōu)先在骨組織中積累。在骨組織中，msc歸巢到它們的目標(biāo)組織，分化成成骨細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子，并有助于增加骨量。同時(shí)，骨微環(huán)境中的dnp通過清除骨質(zhì)疏松環(huán)境中普遍存在的ros促進(jìn)成骨分化并抑制破骨細(xì)胞的發(fā)生。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種增強(qiáng)MSC骨靶向能力的DNA納米貼片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：將環(huán)狀腳手架鏈和訂書釘鏈混合后得到矩形DNA折紙；在骨靶向肽的3'端修飾馬來亞酰胺基團(tuán)，得到馬來亞酰胺基團(tuán)修飾的骨靶向肽，將馬來亞酰胺基團(tuán)修飾的骨靶向肽與5'?-硫醇修飾的短鏈混合，得到骨靶向肽-短鏈；在DNA短鏈上修飾膽固醇，得到膽固醇-短鏈；將矩形DNA折紙、骨靶向肽-短鏈和膽固醇-短鏈混合，得到增強(qiáng)MSC骨靶向能力的DNA納米貼片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)MSC骨靶向能力的DNA納米貼片的制備方法，其特征在于，矩形DNA折紙、骨靶向肽-短鏈和膽固醇-短鏈的摩爾比為1:5~10:10~20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)MSC骨靶向能力的DNA納米貼片的制備方法，其特征在于，將矩形DNA折紙、骨靶向肽-短鏈和膽固醇-短鏈混合后，將混合物加熱至40~50℃，以0.15~0.25℃/min的速度冷卻至20~30℃，得到增強(qiáng)MSC骨靶向能力的DNA納米貼片。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)MSC骨靶向能力的DNA納米貼片的制備方法，其特征在于，所述骨靶向肽-短鏈
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)MSC骨靶向能力的DNA納米貼片的制備方法，其特征在于，所述膽固醇-短鏈的制備方法包括：將DNA短鏈加入含有三氯乙酸的二氯甲烷中，得到脫保護(hù)的DNA短鏈；將脫保護(hù)的DNA短鏈加入5-膽固醇CE與四氮唑的混合物中，得到中間體；將中間體加入在含有乙酸酐和1-甲基咪唑的乙腈溶液中，然后用碘氧化，得到膽固醇-短鏈。
6.一種DNA納米貼片，其特征在于，由權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述制備方法制備而成。
7.權(quán)利要求6所述的DNA納米貼片在制備骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述骨質(zhì)疏松藥物的制備方法包括：將權(quán)利要求6所述的DNA納米貼片錨定于間充質(zhì)干細(xì)胞的表面，得到DNA納米貼片-間充質(zhì)干細(xì)胞，并采用DNA納米貼片-間充質(zhì)干細(xì)胞制備得到骨質(zhì)疏松藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述DNA納米貼片-間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法包括：將權(quán)利要求6所述的DNA納米貼片添加至間充質(zhì)干細(xì)胞懸液中使DNA納米貼片終濃度為4~6?nM，振蕩金屬浴孵育后，使DNA納米貼片錨定于間充質(zhì)干細(xì)胞的表面，得到DNA納米貼片-間充質(zhì)干細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述骨質(zhì)疏松藥物用于提高絕經(jīng)后小鼠骨密度及改善體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種增強(qiáng)msc骨靶向能力的dna納米貼片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：將環(huán)狀腳手架鏈和訂書釘鏈混合后得到矩形dna折紙；在骨靶向肽的3'端修飾馬來亞酰胺基團(tuán)，得到馬來亞酰胺基團(tuán)修飾的骨靶向肽，將馬來亞酰胺基團(tuán)修飾的骨靶向肽與5'?-硫醇修飾的短鏈混合，得到骨靶向肽-短鏈；在dna短鏈上修飾膽固醇，得到膽固醇-短鏈；將矩形dna折紙、骨靶向肽-短鏈和膽固醇-短鏈混合，得到增強(qiáng)msc骨靶向能力的dna納米貼片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)msc骨靶向能力的dna納米貼片的制備方法，其特征在于，矩形dna折紙、骨靶向肽-短鏈和膽固醇-短鏈的摩爾比為1:5~10:10~20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)msc骨靶向能力的dna納米貼片的制備方法，其特征在于，將矩形dna折紙、骨靶向肽-短鏈和膽固醇-短鏈混合后，將混合物加熱至40~50℃，以0.15~0.25℃/min的速度冷卻至20~30℃，得到增強(qiáng)msc骨靶向能力的dna納米貼片。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)msc骨靶向能力的dna納米貼片的制備方法，其特征在于，所述骨靶向肽-短鏈的制備方法包括：將馬來亞酰胺基團(tuán)加入含有o-苯并三唑-n，n，n'和二異丙基乙胺的二甲基甲酰胺溶液中與骨靶向肽反應(yīng)，用三氟乙酸去除肽保護(hù)基團(tuán)，室溫孵育后，純化得到馬來亞酰胺基團(tuán)修飾的骨靶向肽；將馬來亞酰胺基團(tuán)修飾的骨靶向肽與...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：徐又佳，潘盛，何耀，王后禹，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：核工業(yè)總醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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