【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種微環(huán)dna的制備方法，及其在基因治療和細(xì)胞治療中的用途。
技術(shù)介紹
1、dna載體廣泛運(yùn)用于疫苗、基因治療、細(xì)胞治療等領(lǐng)域。傳統(tǒng)的dna載體為帶有原核細(xì)胞復(fù)制起點(diǎn)及抗生素抗性基因的質(zhì)粒。然而這些源自原核生物的dna序列會(huì)抑制順式連接的哺乳類細(xì)胞表達(dá)盒的表達(dá)，刺激dna感知通路(dna?sensing?pathway)，活化t、b淋巴細(xì)胞、nk細(xì)胞及單核細(xì)胞促進(jìn)免疫發(fā)炎反應(yīng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。這些反應(yīng)都限制了質(zhì)粒dna載體應(yīng)用的成效。而原核細(xì)胞復(fù)制起點(diǎn)及抗生素抗性基因的傳播也是使用質(zhì)粒dna載體的風(fēng)險(xiǎn)之一。
2、去除原核細(xì)胞復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因的超螺旋環(huán)狀dna在1997年首先由darquet等人制備出來，并在多種哺乳類細(xì)胞展現(xiàn)了優(yōu)于質(zhì)粒dna載體的蛋白表達(dá)能力。這類dna被稱為微環(huán)dna(minicircle?dna)。chen等人則進(jìn)一步以小鼠為模型，證明當(dāng)將dna載體輸送到小鼠肝臟，微環(huán)dna相較于質(zhì)粒dna，能在周邊血中表達(dá)200-560倍的具臨床醫(yī)療潛力的蛋白質(zhì)。之后，微環(huán)dna的高穩(wěn)定性及高效表達(dá)能力，被廣泛運(yùn)用于面向各類疾病的基因治療或細(xì)胞治療的開發(fā)。微環(huán)dna被嘗試作為基因治療載體，應(yīng)用在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎的前臨床研究。rim等人以微環(huán)表達(dá)bmp2及tgfβ3，誘導(dǎo)得自hipscs的類間充質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，并在大鼠模型成功治療骨軟骨損傷。florian等人則以微環(huán)dna在間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)angiopoietin?1蛋白，提高了間充質(zhì)干細(xì)胞舒緩急
3、微環(huán)dna的制備依賴重組酶將攜帶兩個(gè)重組位點(diǎn)的母質(zhì)粒分割成兩個(gè)較小的環(huán)狀dna。通過對(duì)重組位點(diǎn)在母質(zhì)粒上和其他單元的相對(duì)位置的設(shè)計(jì)，可使得其中一個(gè)環(huán)狀dna攜帶基因治療或細(xì)胞治療所需的功能蛋白或功能rna表達(dá)盒，即微環(huán)dna，而另一個(gè)環(huán)狀dna則攜帶欲去除的原核生物復(fù)制起始點(diǎn)及抗生素抗性基因的單元，一般稱為微質(zhì)粒。目前被報(bào)導(dǎo)可用于制備微環(huán)dna的重組酶有噬菌體λ整合酶、噬菌體φc31整合酶、cre重組酶及para解離酶等。以噬菌體λ整合酶、φc31整合酶及cre重組酶制備的微環(huán)皆帶有二聚體至多聚體的污染。由于這些二聚體及多聚體，其序列和目標(biāo)微環(huán)dna一致，這增加了后續(xù)得到高純度微環(huán)dna的難度。而para解離酶重組效率接近100％且重組后產(chǎn)物不存在二聚體或多聚體污染。得到高純度的微環(huán)還必須配合去除殘留母質(zhì)粒及微質(zhì)粒的技術(shù)。目前常見的做法包括體外酶切去除母質(zhì)粒與微質(zhì)粒；體內(nèi)酶切去除母質(zhì)粒與微質(zhì)粒、親和層析去除母質(zhì)粒與微質(zhì)粒或純化微環(huán)dna等。整體柱層析也被應(yīng)用于進(jìn)一步純化超螺旋微環(huán)dna以達(dá)到臨床使用標(biāo)準(zhǔn)。
4、過繼細(xì)胞免疫療法(adoptive?cellular?immunotherapy)近年來取得巨大成果。隨著美國(guó)食品藥物管理局通過kymriah(novartis?pharmaceuticals?corporation)，yescarta和tecartus(kite?pharma,inc.)，breyanzi(juno?therapeutics,inc.)，abecma(celgene?corporation)，carvykti(janssen?biotech,inc.)等，用于臨床治療復(fù)發(fā)難治型血液瘤，包括大b淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤等惡性血液腫瘤，提供了全新可靠的，可延長(zhǎng)病人的生存期與生活品質(zhì)的治療策略。這些已獲fda通過的過繼性免疫療法，皆以逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體制備。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體所制備的臨床使用的car-t，分別有65％和54％的插入位點(diǎn)位于refseq基因內(nèi)。這些refseq基因內(nèi)的外源基因插入，造成逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體在基因治療和細(xì)胞治療應(yīng)用上的疑慮。睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)已被證實(shí)可接近隨機(jī)的插入人類基因體，相較于逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒及基于其他轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的載體，運(yùn)用于基因治療有較高的安全性。然而非病毒載體系統(tǒng)運(yùn)用于基因治療或細(xì)胞治療最大的障礙在于載體的遞送效率不高。
5、而微環(huán)dna因其高穩(wěn)定性及高表達(dá)量等特性，可大幅提升非病毒dna載體的效率。因此以睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的微環(huán)dna來攜帶car基因來制備car-t，可有效取代高風(fēng)險(xiǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體。
6、因此，本領(lǐng)域?qū)τ谖h(huán)dna藥物的研發(fā)存在極大需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒搭載原核復(fù)制起點(diǎn)、原核篩選標(biāo)記、控制重組酶表達(dá)的可調(diào)控表達(dá)元件、重組酶、兩個(gè)重組酶識(shí)別位點(diǎn)及可供插入目標(biāo)dna序列的多克隆位點(diǎn)等元件，用于生產(chǎn)不含原核復(fù)制起點(diǎn)及原核篩選標(biāo)記等原核來源dna序列的環(huán)狀超螺旋微環(huán)dna。以及使用所述重組質(zhì)粒生產(chǎn)微環(huán)dna的方法。
2、本專利技術(shù)的第一方面，提供了一種重組質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含以下元件：
3、原核復(fù)制起點(diǎn)、原核篩選標(biāo)記、重組酶編碼序列、控制重組酶表達(dá)的可調(diào)控表達(dá)元件、可供插入目標(biāo)dna序列的多克隆位點(diǎn)以及分別位于多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的兩個(gè)重組酶識(shí)別位點(diǎn)；
4、并且，上述元件的排列方式使得所述質(zhì)粒可被表達(dá)的重組酶在兩個(gè)重組酶識(shí)別位點(diǎn)處切割后分為微質(zhì)粒和微環(huán)dna，其中所形成的微環(huán)dna包含可供插入目標(biāo)dna序列的多克隆位點(diǎn)以及插入其中的目標(biāo)dna序列，和殘余重組酶識(shí)別位點(diǎn)；
5、所述重組酶為cinh解離酶(cinh?resolvase)，所述重組酶識(shí)別位點(diǎn)具有如seq?idno:3所示的核苷酸序列或其衍生序列。
6、在另一優(yōu)選例中，所述cinh解離酶包括野生型cinh解離酶及其突變體，其中所述突變體保留了cinh解離酶識(shí)別并切割如seq?id?no:3所示的重組酶識(shí)別位點(diǎn)的活性。
7、在另一優(yōu)選例中，所述cinh解離酶的氨基酸序列如seq?id?no:1所示。
8、在另一優(yōu)選例中，編碼所述cinh解離酶的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。
9、在另一優(yōu)選例中，所述位于多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的兩個(gè)重組酶識(shí)別位點(diǎn)的方向?yàn)橥颍础嗫寺∽R(shí)別位點(diǎn)→。
10、在另一優(yōu)選例中，所述目標(biāo)dna序列選自下組：一段功能dna序列、一組功能rna表達(dá)盒、一組功能蛋白表達(dá)盒、或其組合。
11、在另一優(yōu)選例中，所述目標(biāo)dna序列為在真核細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的蛋白表達(dá)盒；所述轉(zhuǎn)座酶包括(但不限于)sleepy?beauty、piggybac、tol2。
12、在另一優(yōu)選例中，所述目標(biāo)dna序列為轉(zhuǎn)座子，其與轉(zhuǎn)座酶協(xié)作，將所攜帶遺傳信息穩(wěn)定插入原核或真核細(xì)胞基因組。
13、在另一優(yōu)選例中，所述目標(biāo)dna序列包括嵌合抗原受體(car)編碼序列。
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1.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒包含以下元件：
2.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述CinH解離酶包括野生型CinH解離酶及其突變體，其中所述突變體保留了CinH解離酶識(shí)別并切割如SEQ?ID?NO:3所示的重組酶識(shí)別位點(diǎn)的活性。
3.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述目標(biāo)DNA序列選自下組：一段功能DNA序列、一組功能RNA表達(dá)盒、一組功能蛋白表達(dá)盒、或其組合。
4.一種產(chǎn)生微環(huán)DNA的反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系包含：
5.一種用于產(chǎn)生微環(huán)DNA的試劑盒，所述試劑盒包含：
6.一種產(chǎn)生微環(huán)DNA的方法，所述方法包括：
7.一種通過如權(quán)利要求6所述的方法制備得到的微環(huán)DNA，其包含：
8.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含：
9.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒在制備微環(huán)DNA藥物中的用途。
10.如權(quán)利要求7所述的微環(huán)DNA在制備用于疾病治療和/或預(yù)防的藥物中的用途。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒包含以下元件：
2.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述cinh解離酶包括野生型cinh解離酶及其突變體，其中所述突變體保留了cinh解離酶識(shí)別并切割如seq?id?no:3所示的重組酶識(shí)別位點(diǎn)的活性。
3.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述目標(biāo)dna序列選自下組：一段功能dna序列、一組功能rna表達(dá)盒、一組功能蛋白表達(dá)盒、或其組合。
4.一種產(chǎn)生微環(huán)dna的反應(yīng)體系，...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：翁靖杰，陸金華，朱紅，盧得鑫，張杰，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：星塵生物科技上海有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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