【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本申請(qǐng)涉及一種化學(xué)檢測(cè)分析領(lǐng)域，具體涉及一種氮亞硝基化合物衍生化定量方法。
技術(shù)介紹
1、n-亞硝胺類(lèi)化合物因其代謝激活后具有很強(qiáng)的基因毒性，被認(rèn)為是高度致癌的物質(zhì)。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(iarc)的致癌物清單中，n-亞硝基二甲胺(ndma)和n-亞硝基二乙胺(ndea)均被列為2a類(lèi)致癌物。ich?m7指南也明確指出該類(lèi)化合物具有較高的致癌性。n-亞硝基類(lèi)雜質(zhì)的來(lái)源主要包括原料和工藝。例如，在沙坦類(lèi)藥物的合成過(guò)程中，為了引入四唑環(huán)或去除過(guò)量的原料，可能會(huì)引入ndma、ndea和n-亞硝基-n-甲基-4-氨基丁酸(nmba)等雜質(zhì)。在二甲雙胍、雷尼替丁和尼扎替丁的合成過(guò)程中，n-亞硝基類(lèi)基因毒性雜質(zhì)的產(chǎn)生則與使用二甲胺作為前體有關(guān)。
2、隨著研究的深入，越來(lái)越多復(fù)雜結(jié)構(gòu)的氮亞硝基雜質(zhì)被發(fā)現(xiàn)。除了上述小分子外，同時(shí)存在氮亞硝基官能團(tuán)直接結(jié)合上原料藥的可能。以那屈肝素鈣為例，由于在降解肝素的過(guò)程中使用了亞硝酸鈉，使得亞硝基官能團(tuán)直接結(jié)合上肝素的重復(fù)單元的支鏈上。類(lèi)似于該情況的原料藥氮亞硝基副產(chǎn)物分子量跨度大、組分復(fù)雜且結(jié)構(gòu)不確定，極大限制了對(duì)氮亞硝基含量進(jìn)行測(cè)定。此外，含有二級(jí)胺類(lèi)結(jié)構(gòu)的藥物在制劑階段也存在結(jié)合亞硝基結(jié)構(gòu)的風(fēng)險(xiǎn)。
3、現(xiàn)有的對(duì)于此類(lèi)未知結(jié)構(gòu)、復(fù)雜組分的氮亞硝基化合物的檢測(cè)方法為化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，即以氮亞硝基二正丙胺為標(biāo)樣，通過(guò)氫溴酸將氮亞硝基官能團(tuán)化學(xué)裂解為一氧化氮，通過(guò)一氧化氮和臭氧反應(yīng)的能級(jí)躍遷產(chǎn)生的光進(jìn)行定量分析。該方法受限于儀器以及化學(xué)裂解進(jìn)程，得到的色譜圖峰型差、拖尾嚴(yán)重，
4、在雜質(zhì)研究中，小分子的氮亞硝基雜質(zhì)可以通過(guò)簡(jiǎn)單合成或購(gòu)買(mǎi)得到標(biāo)準(zhǔn)品，但復(fù)雜體系中則需要購(gòu)買(mǎi)大量標(biāo)準(zhǔn)品，極大增加了分析成本。而復(fù)雜結(jié)構(gòu)的氮亞硝基標(biāo)準(zhǔn)品通常難以獲得，進(jìn)一步限制了分析方法的研究和開(kāi)發(fā)。
5、本研究可以將未知結(jié)構(gòu)、復(fù)雜組分的含氮亞硝基官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)，通過(guò)衍生化方法將其轉(zhuǎn)化為已知結(jié)構(gòu)，可檢測(cè)易檢測(cè)的目標(biāo)分析物，再借助現(xiàn)有方法對(duì)其進(jìn)行定量分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)氮亞硝基化合物的特異性定量檢測(cè)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中氮亞硝基化合物檢測(cè)的困難，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N檢測(cè)方法：
2、一種氮亞硝基化合物衍生化定量方法，包括以下步驟：
3、步驟1：待測(cè)氮亞硝基化合物樣品衍生化，將1,1-二苯乙烯和氮亞硝基化合物樣品溶解于甲醇中，然后添加甲磺酸，在紫外燈的照射下光照，得到衍生化后的待測(cè)氮亞硝基化合物樣品；
4、步驟2：液相分析衍生化后的氮亞硝基化合物樣品，采用waterstmc18色譜柱(3.5μm，4.6×150nm)進(jìn)行分離，柱溫控制在35℃，流速為0.5ml/min，進(jìn)樣量為10μl，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為290nm，其中，流動(dòng)相a相為含0.1％乙酸水，b相為含0.1％乙酸乙腈，采用流動(dòng)相a:流動(dòng)相b＝(60％～40％):(60％～40％)的比例進(jìn)行分離；
5、步驟3：定量計(jì)算氮亞硝基化合物的含量，氮亞硝基化合物樣品衍生化后轉(zhuǎn)化為α-氨基肟衍生物，通過(guò)對(duì)α-氨基肟衍生物的定量分析，定量計(jì)算氮亞硝基化合物的含量。
6、本申請(qǐng)還提供所述的氮亞硝基化合物衍生化定量方法在檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
7、有益效果：
8、目前對(duì)于復(fù)雜組分氮亞硝基化合物的檢測(cè)大多是在盡可能分離，分別檢測(cè)，這對(duì)分析方法以及儀器提出了很高要求。美國(guó)fda在2024年9月份最新的《人用藥中亞硝胺雜質(zhì)控制》中也給出了，如果在建立了完整的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法前提下，對(duì)于一些藥物結(jié)構(gòu)上沒(méi)有特殊官能團(tuán)、制藥工藝中沒(méi)有引入亞硝胺的風(fēng)險(xiǎn)的藥物可以只對(duì)總的氮亞硝胺含量進(jìn)行控制。
9、但目前沒(méi)有很好的方法對(duì)總的氮亞硝胺進(jìn)行檢測(cè)，只有歐洲藥典ep?10.0提供了一種化學(xué)反應(yīng)-化學(xué)發(fā)光的方法。主要原理將氮亞硝基轉(zhuǎn)化為no，通過(guò)于臭氧反應(yīng)發(fā)光，將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，用于濃度檢測(cè)。但是由于化學(xué)反應(yīng)并非是瞬時(shí)完成的，造成出峰信號(hào)往往達(dá)不到分析檢測(cè)要求。本申請(qǐng)是先將氮亞硝基進(jìn)行捕獲，將其轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)易檢測(cè)的α-氨基肟衍生物。在本申請(qǐng)實(shí)施例中，樣品前處理進(jìn)行研究，提出針對(duì)氮亞硝基化合物的最佳的反應(yīng)條件，使得整個(gè)反應(yīng)過(guò)程可控、方便和可重復(fù)，可以在液相中得到很好的檢測(cè)信號(hào)。
10、本申請(qǐng)通過(guò)一種氮亞硝基標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)定，用多種其他種類(lèi)的氮亞硝基化合物進(jìn)行驗(yàn)證，依然具有很好的檢測(cè)準(zhǔn)確性，表明該方法對(duì)于復(fù)雜組分中多種氮亞硝基化合物可以用同一種方法進(jìn)行檢測(cè)。極大的減輕了分析困難以及不同氮亞硝胺試劑的購(gòu)買(mǎi)成本。
11、本申請(qǐng)還通過(guò)厄貝沙坦這一相對(duì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證明，針對(duì)復(fù)雜藥物結(jié)構(gòu)或組分中的氮亞硝基也能很好的檢測(cè)，為目前復(fù)雜結(jié)構(gòu)中的氮亞硝基檢測(cè)提供一種新的方法。
12、本申請(qǐng)建立了一種簡(jiǎn)便而靈敏的液相色譜定量分析方法，成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)氮亞硝基化合物的定量測(cè)定。該方法具有高度的選擇性、靈敏度和準(zhǔn)確性，適用于復(fù)雜樣品中氮亞硝基化合物的準(zhǔn)確測(cè)定。這一研究為將該方法進(jìn)一步應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全等領(lǐng)域，尤其是對(duì)復(fù)雜藥物結(jié)構(gòu)或復(fù)雜組分的總氮亞硝胺定量分析提供了可行的手段。
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1.一種氮亞硝基化合物衍生化定量方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氮亞硝基化合物衍生化定量方法，其特征在于，所述步驟1中，甲磺酸和氮亞硝基化合物的摩爾質(zhì)量比為(0.5～2):1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氮亞硝基化合物衍生化定量方法，其特征在于，所述步驟1中，所述紫外燈的波長(zhǎng)范圍為365nm～405nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的氮亞硝基化合物衍生化定量方法，其特征在于，所述步驟1中，所述紫外燈的波長(zhǎng)為290nm。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的氮亞硝基化合物衍生化定量方法，其特征在于，所述步驟1中，在紫外燈的照射下光照時(shí)間為0小時(shí)～8小時(shí)。
6.據(jù)權(quán)利要求5所述的氮亞硝基化合物衍生化定量方法，其特征在于，所述步驟1中，在紫外燈的照射下光照時(shí)間為2小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氮亞硝基化合物衍生化定量方法，其特征在于，所述步驟2中，液相檢測(cè)方法的分析時(shí)間及梯度為：
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氮亞硝基化合物衍生化定量方法，其特征在于，所述步驟3中，定量計(jì)算氮亞硝基化合物的方法為：根據(jù)
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的氮亞硝基化合物衍生化定量方法在檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品檢測(cè)以及藥物工藝中基因毒的分析。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種氮亞硝基化合物衍生化定量方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氮亞硝基化合物衍生化定量方法，其特征在于，所述步驟1中，甲磺酸和氮亞硝基化合物的摩爾質(zhì)量比為(0.5～2):1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氮亞硝基化合物衍生化定量方法，其特征在于，所述步驟1中，所述紫外燈的波長(zhǎng)范圍為365nm～405nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的氮亞硝基化合物衍生化定量方法，其特征在于，所述步驟1中，所述紫外燈的波長(zhǎng)為290nm。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的氮亞硝基化合物衍生化定量方法，其特征在于，所述步驟1中，在紫外燈的照射下光照時(shí)間為0小時(shí)～8小時(shí)。
6.據(jù)權(quán)利要求5所述的氮亞硝基化合物衍生化定量方法，其特...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：施海蔚，鄭誠(chéng)坤，程冬，師仁義，陸益紅，袁耀佐，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院江蘇省食品質(zhì)量安全監(jiān)控中心，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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