【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及基因檢測，特別是涉及一種光控核酸探針、端粒酶活性檢測方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、惡性腫瘤是當今社會危害人類生命健康的重大疾病之一，死亡率長期居高不下。盡管近年來在新藥研發(fā)方面取得了重大突破，然而腫瘤的防控情況依然不容樂觀。近年來，隨著工業(yè)化的進一步提升、生態(tài)環(huán)境的破壞、以及食品污染的影響，我國惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，且高于世界平均水平。人口逐漸老齡化、肥胖、缺少運動、吸煙、環(huán)境惡化、膳食結(jié)構(gòu)不平衡等可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的因素，不管在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家均有不同程度的存在，因此腫瘤體外診斷所面臨的形勢極為嚴峻。
2、端粒酶是一種核糖核蛋白復(fù)合物，又稱為端粒末端轉(zhuǎn)移酶，端粒酶由兩部分組成：451個堿基長度的端粒酶rna(htr)和端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(htert)。端粒酶負責線性染色體3’端端粒dna重復(fù)序列(ttaggg)的漸進合成，逆轉(zhuǎn)每輪復(fù)制中dna的丟失，從而補償由末端復(fù)制問題引起的端粒逐漸縮短。這種酶在大多數(shù)體細胞中是失活的，并且似乎只限于某些類型的細胞，如生殖系和自我更新組織中的增殖細胞。癌癥的一個普遍特征是與端粒維持機制的激活相關(guān)的無限期細胞分裂，研究人員們發(fā)現(xiàn)端粒酶在癌細胞中廣譜地高表達，在大多數(shù)(約90％)癌細胞系中可觀察到端粒酶再激活，而在正常細胞中呈低表達或者不表達活性。如今，大量的研究結(jié)果清晰地表明端粒酶是一種能反映腫瘤早期發(fā)生的生物標志物，端粒酶不但可用于設(shè)計抗腫瘤藥物的靶點，而且可以作為腫瘤早期診斷、預(yù)后和治療的通用分子標志物和潛在治療靶點。端粒酶活性檢測樣本可來源于細胞、
3、然而，現(xiàn)有主流技術(shù)方法無法在原理層面解決端粒酶活性檢測存在的幾方面問題，其中最重要的一個就是檢測靈敏度受限的問題，從而限制了端粒酶這一腫瘤標志物在醫(yī)學診斷中的進一步應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供一種光控核酸探針，端粒酶可識別該光控核酸探針中的引物并形成端粒酶延伸產(chǎn)物，而間隔分子較少端粒酶延伸產(chǎn)物的空間位阻效應(yīng)，探針修飾的標記物使端粒酶延伸產(chǎn)物能夠被捕獲、富集于載體上，再通過光照射使pc?linker斷裂，探針中的端粒酶延伸產(chǎn)物部分從載體表面釋放到溶液中，進而能夠在不攜帶載體或雜質(zhì)的情況下轉(zhuǎn)移到后續(xù)的擴增反應(yīng)體系中進行擴增，從而消除端粒酶樣本中的雜質(zhì)成分對檢測反應(yīng)的影響，保證對復(fù)雜樣本進行端粒酶活性檢測時的靈敏度。
2、本專利技術(shù)提供了一種光控核酸探針，包括引物、間隔分子，所述間隔分子修飾有pclinker、標記物，所述pc?linker位于所述間隔分子與所述引物之間；端粒酶可識別所述引物并形成端粒酶延伸產(chǎn)物。
3、本專利技術(shù)人在針對上述技術(shù)問題研究過程中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有檢測技術(shù)不能消除端粒酶樣本(裂解產(chǎn)物)中的雜質(zhì)對檢測反應(yīng)的不利影響，如核酸酶對端粒酶延伸過程的抑制，和酶、離子、肽等細胞內(nèi)容物對檢測反應(yīng)的抑制。具體體現(xiàn)在如下方面：首先，在復(fù)雜的臨床標本中(尤其是癌癥早期)，腫瘤細胞占比很低，就會造成獲得的端粒酶樣本中的端粒酶活性難以檢測到。為了避免這種情況，需要使用量更大、濃度更高的生物樣本，以防止端粒酶漏檢，而這又會造成端粒酶樣本中雜質(zhì)濃度的大幅升高，檢測反應(yīng)產(chǎn)生明顯的抑制作用。其次，是端粒酶樣本中的dna酶對端粒酶延伸產(chǎn)物的降解作用。上述因素均會影響端粒酶活性檢測技術(shù)的靈敏度，限制了端粒酶這一腫瘤標志物在醫(yī)學診斷中的進一步應(yīng)用。同時，目前已知的一些端粒酶檢測技術(shù)，多采用經(jīng)修飾的磁珠或微球等載體對端粒酶或相關(guān)產(chǎn)物進行捕獲，但捕獲后因無法較好地實現(xiàn)釋放，只能將載體連同端粒酶或相關(guān)產(chǎn)物一并送入后續(xù)檢測體系，而載體的大量引入，導(dǎo)致后續(xù)檢測體系只能采用熒光檢測等成本較高的方法，較難與dna擴增體系等方便、成本適中的方法適配。若要消除端粒酶樣本中雜質(zhì)成分對檢測反應(yīng)的影響，保證對復(fù)雜樣本進行端粒酶活性檢測的靈敏度，同時還需要與dna擴增體系等適配，則需要讓端粒酶先形成端粒酶延伸產(chǎn)物，并能夠?qū)⒍肆Ｃ秆由飚a(chǎn)物獨立地從復(fù)雜樣本中脫離出來，在不攜帶載體或雜質(zhì)的情況下進入后續(xù)的擴增體系、檢測反應(yīng)體系。故，本專利技術(shù)人提出上述光控核酸探針，端粒酶可識別該光控核酸探針中的引物并形成端粒酶延伸產(chǎn)物，而探針修飾的標記物使端粒酶延伸產(chǎn)物能夠被捕獲、富集于載體上，再通過光照射使pclinker斷裂，探針中的端粒酶延伸產(chǎn)物部分從分離載體表面釋放到溶液中，進而能夠在不攜帶載體或雜質(zhì)的情況下轉(zhuǎn)移到后續(xù)的擴增反應(yīng)體系中進行擴增，從而消除端粒酶樣本中的雜質(zhì)成分對檢測反應(yīng)的影響，保證對復(fù)雜樣本進行端粒酶活性檢測時的靈敏度。上述間隔分子用于減少所述端粒酶延伸產(chǎn)物與探針的其他官能團之間的空間位阻效應(yīng)。
4、在其中一個實施例中，所述引物的序列為aatccgtcgacgagagtta。
5、在其中一個實施例中，所述標記物包括生物素、異硫氰酸熒光素或地高辛中的至少1種。
6、在其中一個實施例中，所述間隔分子用于減少所述端粒酶延伸產(chǎn)物的空間位阻效應(yīng)。
7、在其中一個實施例中，所述間隔分子包括生物分子或化學分子中的至少1種。
8、可以理解的，因間隔分子用于減少端粒酶延伸產(chǎn)物與探針的其他官能團之間的空間位阻效應(yīng)，故間隔分子可采用生物分子(例如核酸片段、蛋白片段等)，也可采用化學分子(例如聚合物分子等)，使端粒酶延伸產(chǎn)物與探針的其他官能團之間間隔一定空間距離，間隔分子的長度能夠滿足減少空間位阻效應(yīng)的要求即可。
9、在其中一個實施例中，所述生物分子包括8-50個堿基；所述化學分子包括聚合物分子。
10、在其中一個實施例中，所述生物分子為堿基序列。
11、在其中一個實施例中，所述堿基序列為poly尾結(jié)構(gòu)。
12、在其中一個實施例中，所述poly尾結(jié)構(gòu)的序列為8-10個堿基。
13、在其中一個實施例中，所述聚合物分子包括peg。
14、本專利技術(shù)還提供了一種用于端粒酶活性檢測的試劑盒，包括分離體系和檢測體系，所述分離體系包括修飾有結(jié)合物的載體和延伸反應(yīng)體系，所述結(jié)合物與所述標記物特異性結(jié)合，所述延伸反應(yīng)體系包括所述光控核酸探針。
15、可選擇透光材料制成的載體，通過修飾了結(jié)合物的載體捕獲修飾了標記物的探針后，光透過載體照射探針，使pc?linker斷裂；也可選擇非透光材料制成的載體，通過移除載體的遮光物，使探針暴露于光照射之中，進而使pc?linker斷裂。
16、在其中一個實施例中，所述載體主要由透光材料制成。
17、在其中一個實施例中，所述結(jié)合物包括鏈霉親和素、抗異硫氰酸熒光素抗體或抗地高辛抗體中的至少1種。
18、在其中一個實施例中，所述檢測體系包括擴增體系和檢測反應(yīng)體系。
19、在其中一個實施例中，所述擴增體系為as-trap擴增體系，所述檢測反應(yīng)體系為crispr-cas檢測體系。
2本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種光控核酸探針，其特征在于，包括引物、間隔分子，所述間隔分子修飾有PClinker、標記物，所述PC?linker位于所述間隔分子與所述引物之間；端粒酶可識別所述引物并形成端粒酶延伸產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光控核酸探針，其特征在于，所述引物的序列為AATCCGTCGACGAGAGTTA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光控核酸探針，其特征在于，所述標記物包括生物素、異硫氰酸熒光素或地高辛中的至少1種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光控核酸探針，其特征在于，所述間隔分子包括生物分子或化學分子中的至少1種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的光控核酸探針，其特征在于，所述生物分子包括8-50個堿基；所述化學分子包括聚合物分子。
6.一種用于端粒酶活性檢測的試劑盒，其特征在于，包括分離體系和檢測體系，所述分離體系包括修飾有結(jié)合物的載體和延伸反應(yīng)體系，所述結(jié)合物與所述標記物特異性結(jié)合，所述延伸反應(yīng)體系包括權(quán)利要求1-5中任一項所述的光控核酸探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述結(jié)合物包括鏈霉親和素、抗異硫
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測體系包括擴增體系和檢測反應(yīng)體系。
9.一種非診斷目的的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：制備得到端粒酶延伸產(chǎn)物，對端粒酶延伸產(chǎn)物進行擴增、檢測；
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述捕獲通過標記物與結(jié)合物的特異性結(jié)合實現(xiàn)。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種光控核酸探針，其特征在于，包括引物、間隔分子，所述間隔分子修飾有pclinker、標記物，所述pc?linker位于所述間隔分子與所述引物之間；端粒酶可識別所述引物并形成端粒酶延伸產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光控核酸探針，其特征在于，所述引物的序列為aatccgtcgacgagagtta。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光控核酸探針，其特征在于，所述標記物包括生物素、異硫氰酸熒光素或地高辛中的至少1種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光控核酸探針，其特征在于，所述間隔分子包括生物分子或化學分子中的至少1種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的光控核酸探針，其特征在于，所述生物分子包括8-50個堿基；所述化學分子包括聚合物分子。
6.一種...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：程猛，向波，韓秀晶，
申請(專利權(quán))人：廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院廣州呼吸中心，
類型：發(fā)明
國別省市：
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