【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于蛋白質檢測，具體涉及一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法。
技術介紹
1、生物制品，如抗體藥物、重組蛋白藥物等的制備是通過生物體系合成，盡管能夠通過多種純化過程有效地去除多種雜質，但生產工藝過程中仍然可能會殘留微量的宿主細胞蛋白(host?cell?proteins,hcps)。單抗類藥物中殘留的hcps是生物制品生產過程中的關鍵工藝相關雜質之一，hcps作為外源蛋白可能會在不同程度上引發機體的免疫應答，導致過敏或其它不良反應，也有可能引起產品中輔料成分的降解，影響藥物的穩定性。因此，對抗體藥物中hcps的定性與定量檢測顯得尤為重要。
2、酶聯免疫吸附法(enzyme?linked?immunosorbent?assay,elisa)一直是生物制品開發和質量控制中檢測hcps的最常用方法，但是其對hcps的覆蓋和具體識別信息仍然具有局限性，該方法中使用的多克隆抗體無法覆蓋到無免疫原性或免疫原性較弱的hcps。鑒于高分辨質譜作為一種高精密度、高準確性的檢測方法，其對hcps的檢測有較好的特異性，可應用于單抗類藥物生產工藝中hcps的監測。
技術實現思路
1、本專利技術旨在提供一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，該方法有助于更全面識別單抗類藥物中低豐度宿主細胞殘留蛋白，能夠高效、準確地測定單抗類藥物中宿主細胞蛋白殘留量。
2、為實現上述專利技術目的，本專利技術通過以下技術方案實現：
3、一種單抗類藥物低豐度
4、(s.1)分別稱取各內標蛋白并用緩沖液配制、稀釋得到各內標蛋白工作液；
5、(s.2)向超濾管中加入超純水并離心，去除甘油，然后加入單抗樣品并離心，加入緩沖液進行置換，得到置換后的單抗樣品溶液并對其進行總蛋白量測定；
6、(s.3)向經過預飽和的離心管中加入步驟(s.2)中得到的置換后的單抗樣品溶液，并加入步驟(s.1)中得到的各內標蛋白工作液，再加入緩沖液混勻，得到混合液；混合液經非變性酶解、沉淀去除單抗主蛋白，采用脫氧膽酸鈉變性酶解，得到酶解肽段；然后向酶解肽段中加入甲酸，去除生成的脫氧膽酸鈉沉淀，再對酶解肽段進行脫鹽、復溶處理，離心，取上清，得到包含宿主殘留蛋白的肽段和各內標蛋白的肽段的混合肽段溶液并對其進行總肽段含量測定，將混合肽段溶液轉移至進樣瓶，得到待測進樣溶液；
7、(s.4)采用納升液相色譜-串聯高分辨質譜對步驟(s.3)中得到的待測進樣溶液進行檢測并收集數據，采用蛋白組學數據處理軟件proteome?discoverer?3.0進行數據分析，分別篩選并計算得到有無單抗基質的樣品中內標蛋白的響應值，從而計算得到內標蛋白回收率校正因子，篩選并計算得到宿主殘留蛋白的響應值，進一步計算得到單抗樣品中宿主殘留蛋白的含量。
8、由于在單抗類藥物中存在藥物基質的影響，本專利技術基于蛋白組學的非標記定量技術，即利用蛋白響應最高的3條肽段(hi3?peptides)響應之和的比值與其物質的量成正比，通過引入內標蛋白回收率校正因子，利用內標蛋白對單抗樣品中的宿主殘留蛋白進行相對定量。本專利技術的定量檢測方法有助于更全面識別單抗類藥物中低豐度宿主細胞殘留蛋白，提升基于蛋白組學技術的單抗類藥物中低豐度宿主細胞殘留蛋白相對定量方法的準確性，可用于評估單抗類藥物中宿主細胞蛋白殘留量，為生物制品質量控制提供技術支持。本專利技術的定量檢測方法能夠鑒定到的含量最低的外源性宿主細胞殘留蛋白的質量濃度約為0.3ppm，檢測下限低，結合質譜分析方法，檢測高效、準確，精密度高。
9、本專利技術基于非靶向蛋白質組學，對單抗中包含的蛋白進行全面分析，從而獲得宿主殘留蛋白定性信息。同時，本專利技術通過添加的內標蛋白，在計算時引入內標蛋白回收率校正因子，進一步得到單抗樣品中所有宿主殘留蛋白相對定量結果。
10、作為優選，步驟(s.1)中的內標蛋白為細胞色素c、α-乳蛋白、c反應蛋白、硫氧還蛋白1、肌紅蛋白、血紅蛋白s中的任意一種或多種的組合。
11、作為優選，步驟(s.3)中對離心管進行預飽和的具體方法如下：
12、用牛血清白蛋白對離心管進行預飽和，使用前棄去離心管中的溶液。
13、作為優選，步驟(s.3)中按置換后的單抗樣品溶液中每含有500μg單抗蛋白加入10ppm的硫氧還蛋白1、15ppm的肌紅蛋白、20ppm的細胞色素c、40ppm的血紅蛋白s、50ppm的α-乳蛋白和50ppm的c反應蛋白。
14、作為優選，步驟(s.3)中得到酶解肽段的具體過程為：
15、向混合液中按酶:蛋白＝1:400(w/w)加入胰蛋白酶，37℃酶切2h；加入二硫蘇糖醇使其終濃度為5mm，95℃變性10min，14000g離心15min，取上清；加入10％脫氧膽酸鈉使其終濃度為1％；加入二硫蘇糖醇使其終濃度為5mm，95℃反應10min，冷卻至室溫；加入碘乙酰胺使其終濃度為10mm，避光反應30min；加入胰蛋白酶，37℃酶切過夜；加入10％甲酸使其終濃度為1％，混勻，14000g離心15min，取上清。
16、作為優選，步驟(s.3)中脫鹽、復溶處理的具體過程為：
17、用c18脫鹽柱對酶解肽段進行脫鹽處理后，去除溶劑，用甲酸-水溶液復溶。
18、作為優選，步驟(s.4)中計算得到內標蛋白回收率校正因子的計算公式如下：
19、
20、作為優選，步驟(s.4)中分別篩選并計算得到有無單抗基質的樣品中內標蛋白的響應值的方法如下：
21、采用蛋白組學數據處理軟件proteome?discoverer?3.0進行數據分析得到數據表，從數據表中篩選出響應最高的3條肽段，計算響應最高的3條肽段的響應值之和并將其作為內標蛋白的響應值。
22、作為優選，步驟(s.4)中計算得到單抗樣品中宿主殘留蛋白的含量的計算公式如下：
23、式中：i表示內標蛋白，n表示內標蛋白數量。
24、作為優選，步驟(s.4)中篩選并計算得到宿主殘留蛋白的響應值的方法如下：
25、采用蛋白組學數據處理軟件proteome?discoverer?3.0進行數據分析得到數據表，從數據表中篩選出特征肽段數量不小于2的目標蛋白并從目標蛋白對應的肽段中選取肽段，計算選取得到的肽段的響應值之和并將其作為宿主殘留蛋白的響應值。
26、因此，本專利技術具有以下有益效果：
27、(1)本專利技術基于蛋白組學的非標記定量技術，即利用蛋白響應最高的3條肽段(hi3peptides)響應之和的比值與其物質的量成正比，通過引入內標蛋白回收率校正因子，利用內標蛋白對單抗樣品中的宿主殘留蛋白進行相對定量；
28、(2)本專利技術的定量檢測方法有助于更全面識別單抗類藥物中低豐度宿主細胞殘留蛋白，提升基于蛋白組學技術的單抗類藥物中低豐度宿主細胞殘留蛋白相對本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：(S.1)分別稱取各內標蛋白并用緩沖液配制、稀釋得到各內標蛋白工作液；
2.根據權利要求1所述的一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，其特征在于，步驟(S.1)中的內標蛋白為細胞色素c、α-乳蛋白、C反應蛋白、硫氧還蛋白1、肌紅蛋白、血紅蛋白S中的任意一種或多種的組合。
3.根據權利要求1所述的一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，其特征在于，步驟(S.3)中對離心管進行預飽和的具體方法如下：
4.根據權利要求1所述的一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，其特征在于，步驟(S.3)中按置換后的單抗樣品溶液中每含有500μg單抗蛋白加入10ppm的硫氧還蛋白1、15ppm的肌紅蛋白、20ppm的細胞色素c、40ppm的血紅蛋白S、50ppm的α-乳蛋白和50ppm的C反應蛋白。
5.根據權利要求1所述的一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，其特征在于，步驟(S.3)中得到酶解肽段的具體過程為：>
6.根據權利要求1所述的一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，其特征在于，步驟(S.3)中脫鹽、復溶處理的具體過程為：
7.根據權利要求1所述的一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，其特征在于，步驟(S.4)中計算得到內標蛋白回收率校正因子的計算公式如下：
8.根據權利要求1或7所述的一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，其特征在于，步驟(S.4)中分別篩選并計算得到有無單抗基質的樣品中內標蛋白的響應值的方法如下：
9.根據權利要求1所述的一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，其特征在于，步驟(S.4)中計算得到單抗樣品中宿主殘留蛋白的含量的計算公式如下：
10.根據權利要求1所述的一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，其特征在于，步驟(S.4)中篩選并計算得到宿主殘留蛋白的響應值的方法如下：
...【技術特征摘要】
1.一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：(s.1)分別稱取各內標蛋白并用緩沖液配制、稀釋得到各內標蛋白工作液；
2.根據權利要求1所述的一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，其特征在于，步驟(s.1)中的內標蛋白為細胞色素c、α-乳蛋白、c反應蛋白、硫氧還蛋白1、肌紅蛋白、血紅蛋白s中的任意一種或多種的組合。
3.根據權利要求1所述的一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，其特征在于，步驟(s.3)中對離心管進行預飽和的具體方法如下：
4.根據權利要求1所述的一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘留蛋白的定量檢測方法，其特征在于，步驟(s.3)中按置換后的單抗樣品溶液中每含有500μg單抗蛋白加入10ppm的硫氧還蛋白1、15ppm的肌紅蛋白、20ppm的細胞色素c、40ppm的血紅蛋白s、50ppm的α-乳蛋白和50ppm的c反應蛋白。
5.根據權利要求1所述的一種單抗類藥物低豐度宿主細胞殘...
【專利技術屬性】
技術研發人員：余捷婧，曾實，楊志行，李炎，馬全剛，
申請(專利權)人：湖州申科生物技術股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。