【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，具體說是一種zmcipk4蛋白及其編碼基因在調控玉米耐受低溫脅迫中的應用。
技術介紹
1、隨著世界耕地面積逐漸減少以及世界人口數量的增加，人們對糧食的需求越來越大。玉米作為世界三大糧食作物之一，其野生祖先是墨西哥類蜀黍，在距今九千年多年目前首次被人類馴化，在距今4000多年前玉米開始出現在美國西南部地區，而之后玉米的種植區域開始向世界各個地區擴散，而在這個過程中，玉米的種植環境由熱帶地區逐漸轉移向亞熱帶及溫帶地區，伴隨這這個過程中玉米生長的環境溫度逐漸降低，與此同時玉米是一種對溫度較為敏感的作物。在所有生物及環境逆境中，低溫脅迫是影響農作物存活及產量的主要限制因子之一，低溫脅迫對玉米苗期萌發及幼苗的存活和成熟期子粒灌漿過程具有重要影響。因此，研究玉米耐受低溫脅迫影響對玉米生產具有重大意義。傳統的育種技術培育和改良耐脅迫性狀難度相對較大，不能快速高效的得到優良的耐冷品種。而隨著分子生物學技術的發展，以及對植物抗逆分子機制的深入研究，以及人類在在基因工程研究中取得重大進展。采用轉基因等基因工程手段向植物導入抗逆性外源基因已成為改良植物抗逆性的新途徑之一。
2、ca2+在發育和環境信號引發的細胞內信號傳導中作為第二信使起著至關重要的作用。鈣調磷酸酶b樣蛋白(cbls)及其靶蛋白cbls相互作用蛋白激酶(cipks)已成為植物鈣調磷酸酶介導的脅迫應答信號網絡。
3、cbls是鈣結合蛋白，含有ef-hand結構域，作為ca2+結合的結構基礎，并與ca2+信號傳導中一組被稱為cbl相互作用蛋白激酶
4、cbl-cipks復合物是一種復雜的鈣信號系統，對植物中的各種脅迫作出反應。zmcipk基因分別在鹽脅迫、干旱脅迫、熱脅迫和冷脅迫下表達上調。耐冷自交系b73和冷敏感自交系mo17在冷脅迫下zmcipks的表達模式不同。
技術實現思路
1、針對現有技術中存在的缺陷，本專利技術的目的在于提供zmcipk4蛋白及其編碼基因在調控玉米耐受低溫脅迫中的應用。通過敲除zmcipk4基因，可以增強玉米的抗低溫性狀(離子滲透率、滲透勢等)，對于培育抗逆境(耐冷)玉米新品種提供了重要可能性，對農業生產具有重大意義。
2、為達到以上目的，本專利技術采取的技術方案是：
3、zmcipk4蛋白在調控玉米耐受低溫脅迫中的應用，其特征在于，所述應用包括：
4、(1)提高玉米耐受低溫脅迫能力；
5、(2)選育耐低溫脅迫的玉米品種；
6、所述zmcipk4蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。
7、zmcipk4基因在調控玉米耐受低溫脅迫中的應用，其特征在于，所述應用包括：
8、(1)提高玉米耐受低溫脅迫能力；
9、(2)選育耐低溫脅迫的玉米品種；
10、所述zmcipk4基因用于編碼權利要求1中所述的zmcipk4蛋白；
11、所述玉米耐受低溫脅迫能力具體為：玉米的離子滲透率提高，玉米的滲透勢提高，玉米苗期的耐冷性提高。
12、在上述方案的基礎上，所述應用通過敲除玉米植株中的zmcipk4基因以提高玉米耐受低溫脅迫能力，或者對具有耐低溫脅迫的玉米品種進行選育。
13、上述應用中，通過crispr/cas9技術將含有所述蛋白質的編碼基因靶點的的重組表達載體導入所述受體b73-329受體玉米中。
14、所述重組表達載體可用現有的植物表達載體構建。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pcambia-1300-221、pgreen0029、pcambia3301、pbd121、pbin19、pcambia2301、pcambia1301-ubin或其它衍生植物表達載體。上述重組表達載體將序列4所述靶點序列通過雙引物擴增的方法擴增于中間載體pcbc-mt1t2然后通過bsa1酶切位點連接在pbue411載體上。使用所述基因構建重組表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，例如花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動子、泛素基因ubiquitin啟動子(pubi)、脅迫誘導型啟動子rd29a等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用重組表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因等。也可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
15、在本專利技術中，所述重組表達載體中啟動所述蛋白質的編碼基因轉錄的啟動子為水稻u6啟動子。
16、zmcipk4基因，其特征在于，所述zmcipk4基因的核苷酸序列為：
17、(1)seq?id?no.1所示核苷酸序列；
18、(2)seq?id?no.2所示核苷酸序列。
19、上述zmcipk4基因的靶點序列，其特征在于，所述zmcipk4基因的靶點序列如seqid?no.4所示。該靶點序列是位于外顯子上的grna序列。
20、更為具體的，所述重組表達載體為：將所述zmcipk4基因靶點序列(如seq?id?no.4所示)插在pbue411載體的多克隆位點bsa1之間后得到的重組質粒。
21、進一步地，將攜帶有所述zmcipk4基因單靶點序列的的所述重組表達載體導入所述受體植物，具體可為：通過使用ti質粒、ri質粒、植物病毒載體、直接dna轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。
22、本專利技術所述的zmcipk4蛋白及其編碼基因在調控玉米耐受低溫脅迫中的應用，其有益效果為：
23、zmcipk4基因的純合敲除株系，相比野生型對照植株，對低溫逆境脅迫的耐受性顯著提高。本專利技術對玉米的耐冷的分子機制的研究具有重要意義；另外，該基因在培育耐冷玉米品種中具有重要功能，從而為培育抗逆境作物新品種提供了重要的可能性，對農業生產具有重大意義。
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1.ZmCIPK4蛋白在調控玉米耐受低溫脅迫中的應用，其特征在于，所述應用包括：
2.ZmCIPK4基因在調控玉米耐受低溫脅迫中的應用，其特征在于，所述應用包括：
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述應用通過敲除玉米植株中的ZmCIPK4基因以提高玉米耐受低溫脅迫能力，或者對具有耐低溫脅迫的玉米品種進行選育。
4.如權利要求2中所述的ZmCIPK4基因，其特征在于，所述ZmCIPK4基因的核苷酸序列為：
5.如權利要求2中所述ZmCIPK4基因的靶點序列，其特征在于，所述ZmCIPK4基因的靶點序列如SEQ?ID?NO.4所示。
【技術特征摘要】
1.zmcipk4蛋白在調控玉米耐受低溫脅迫中的應用，其特征在于，所述應用包括：
2.zmcipk4基因在調控玉米耐受低溫脅迫中的應用，其特征在于，所述應用包括：
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述應用通過敲除玉米植株中的zmcipk4基因以提高玉米耐受低溫脅迫...
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