本發明專利技術屬于基因工程和生物技術領域，公開了一種用于視網膜廣泛靶向與表達的腺相關病毒AAV?8型血清型的改造型，還涉及該改造型的構建及應用。在如SEQ?ID?NO.2所示的AAV?8型血清型衣殼蛋白序列的第590位氨基酸與第591位氨基酸之間插入如SEQ?ID?NO.3所示的10個氨基酸序列，其中第1、第2和第10位的氨基酸為保護氨基酸，第3至第9位氨基酸為篩選獲得的氨基酸序列。本發明專利技術的改造型血清型感染后的熒光效果更強，能夠明顯且直觀的觀察，外源基因能夠在特定靶向組織視網膜整體區域進行廣泛、高效的表達，在使用相同病毒量的情況下，比野生型血清型有更好及更廣泛的靶向組織表達以及更少的非靶向組織表達。
1、aav是一種有dna缺陷的非致病性細小病毒，重組腺相關病毒載體(raav)源于非致病的野生型腺相關病毒，具有免疫原性弱、安全性好、宿主范圍廣、感染效率高且組織特異性強等特點，是理想的基因表達載體，已經被fda批準用于臨床實驗。
2、目前aav病毒包裝系統中使用aav病毒衣殼蛋白，較多使用的是傳統的野生型的aav1、2、5、8和9型衣殼蛋白，并且具有不同的組織或細胞的特異性。這類天然野生型aav病毒衣殼，雖然能夠將aav有效地靶向目的組織進行外源基因的表達，如aav1可以高效感染骨骼肌細胞，aav2能夠感染視網膜細胞，aav-8型可將外源基因高效傳遞至肝細胞，aav9具有跨血腦屏障的能力并將外源基因在中樞神經系統以及腦部表達等等。病毒的天然親嗜性決定了靶向傳遞治療的基礎，另一方面也為改造這些病毒衣殼，使其具有更高的滲透能力，更持久的表達時間以及更低的免疫原性提供了平臺。
3、鑒于aav已被廣泛運用于各類疾病的臨床前研究，當務之急是針對天然野生型aav衣殼蛋白的靶向性改造修飾與優化。目前，用于aav衣殼蛋白進行改造優化的方法有很多，包括dna?shuffling技術、衣殼蛋白氨基酸定點突變和人工插入、刪除氨基酸序列改造衣殼蛋白修飾等等。其中，近年來發展而來的基于噬菌體展示系統技術，從隨機肽段庫中篩選特異靶向的短肽段插入野生型aav衣殼蛋白的特定位點，是一種高效，可行的篩選方法。
/>技術實現思路
1、本專利技術要解決的技術問題之一是篩選一種用于視網膜廣泛靶向與高效表達的aav-8型血清型的改造型的構建方法及其應用。
2、本專利技術要解決的技術問題之二是提供該改造型血清型的構建方法。
3、本專利技術通過眼球玻璃體注射，篩選到一個新型aav-8改造型衣殼aav8-590mj05。即通過使用體外進化篩選的方法，在aav-8野生型衣殼的第590位氨基酸和第591位氨基酸之間插入10個氨基酸，其中包括7個隨機氨基酸、5’端2個保護氨基酸la和3’端1個保護氨基酸a。經過一步病毒包裝，使得每個aav病毒衣殼只帶有獨特唯一的10個氨基酸序列插入，并對應其aav的基因組序列，將這一病毒注射在小鼠的玻璃體中，約1周后取小鼠的視網膜及脈絡膜，提取并分析其基因組，觀察是否有aav病毒從玻璃體滲透到視網膜整體區域。
4、本專利技術要解決的技術問題之三是提供該改造型血清型aav8-590mj05的應用。
5、為解決上述技術問題，本專利技術采用如下技術方案：
6、在本專利技術的第一方面，提供一種用于基因靶向與表達的aav-8型血清型的改造型血清型。在如seq?id?no.2所示的aav-8型血清型衣殼蛋白的第590位氨基酸與第591位氨基酸之間插入由10個氨基酸構成的多肽，由10個氨基酸構成的多肽含有氨基酸序列如seq?idno.5所示所述的多肽。優選地，在如seq?id?no.2所示的aav-8型血清型衣殼蛋白序列的第590位氨基酸與第591位氨基酸之間插入如seq?id?no.3所示的10個氨基酸序列：lagggrvtga，其中第1、第2和第10位的氨基酸為保護氨基酸，第3至第9位氨基酸為篩選獲得的氨基酸序列。
7、更優地，所述如seq?id?no.3所示的10個氨基酸序列，其對應的堿基序列如seq?idno.4所示。所述用于基因靶向與表達的aav-8型血清型的改造型衣殼蛋白序列如seq?idno.1所示。
8、本專利技術中，所述改造型血清型插入的氨基酸序列lagggrvtga可用于構建aav病毒包裝用的衣殼，或者用于生物大分子、抗體藥物、肽段和化學小分子的連接及靶向。
9、本專利技術構建含有對應如seq?id?no.3所示的10個氨基酸序列(7個隨機氨基酸序列及3個保護氨基酸)的30個堿基序列的aav血清型，包括cap基因、rep基因，選擇性的標記ampicillin抗性基因；在所述cap蛋白的第590位氨基酸與第591位氨基酸對應的堿基之間插入如seq?id?no.4所示的相對應的30個堿基。ampicillin抗性基因即抗生素抗性基因，其目的是使成功導入載體的細菌對抗生素產生抗性，從而能夠篩選并擴增aav載體。
10、在本專利技術的第二方面，還提供上述血清型的構建方法。可以采用常規的基因合成或者多肽合成的方法，也可以參考如下步驟：
11、第一步，合成隨機的21個堿基以及在5’端和3’端添加保護堿基cttgct和gcc，插入aav-8cap基因的第590位和591位氨基酸對應的堿基序列之中，形成aav衣殼；
12、第二步，將上述aav衣殼載體，電擊轉化若干個感受態，每個感受態在luria-bertani(lb)培養基培養過夜，次日于每個培養基中取菌液混合接種于lb培養基搖菌過夜，剩余菌液甘油保存(隨機片段庫)；質粒抽提，得到混合載體庫，命名為paav8-590-7aa。
13、第三步，輔助質粒、rep2-aav8質粒、pegfp-n1與paav8-590-7aa(10ng)進行aav病毒的包裝和純化；
14、第四步，將aav病毒進行c57bl/6j品系小鼠的玻璃體腔注射給藥，取視網膜層和脈絡膜層，提取視網膜層和脈絡膜層的基因組dna，檢測aav-8cap基因590位氨基酸對應的堿基序列后的21個氨基酸并測序；
15、第五步，分析測序結果并pcr擴增隨機序列，確定10個氨基酸序列，將其插入aav-8cap基因的第590位和591位，aav病毒包裝，通過眼球玻璃體腔注射感染視網膜，比較aav-8與aav8-590mj05的感染差異。
16、在本專利技術的第二方面，還提供了上述核酸在制備治療視網膜相關疾病藥物中的應用。
17、本專利技術的多肽可以用于制備治療視網膜相關疾病藥物。優選地，所述的治療視網膜相關疾病藥物是靶向整體視網膜的藥物。
18、優選地，所述的治療視網膜相關疾病藥物是通過玻璃體注射，能夠增加視網膜整體感染效率、增加視網膜滲透效率的藥物或者提高視網膜識別效率的藥物。
19、更優地，所述的細胞層中的細胞選自視網膜神經節分離細胞、neuro2a細胞、u251細胞、arpe-19細胞、sh-sy-5y細胞、bv2細胞、hbmec原代分離細胞、jurkat細胞、k562細胞、293細胞或者thp1細胞中的一種或者多種。
20、與野生型aav-8血清型相比，本專利技術aav8-590mj05改造型血清型通過玻璃體腔注射在感染視網膜整體中的應用與比較實驗顯示，本專利技術具有如下有益效果：
21、aav-8改造型血清型能夠通過眼球玻璃體腔注射，更廣泛(圖3)、更高效(圖4)地感染視網膜整體區域。
22、與aav-8野生型血清型相比，aav-8改造型血清型通過玻璃體腔注射，具有更少的臟器脫靶效應(圖5)。
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【技術保護點】
1.一種多肽，其特征在于，在如SEQ?ID?NO.2所示的AAV-8型血清型衣殼蛋白的第590位氨基酸與第591位氨基酸之間插入由10個氨基酸構成的多肽，由10個氨基酸構成的多肽含有氨基酸序列如SEQ?ID?NO.5所示所述的多肽。
2.根據權利要求1所述的多肽，其特征在于，其第1—590位氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示的AAV-8型血清型衣殼蛋白序列的第1—590位氨基酸序列所示，第591—600位氨基酸中第593—599位氨基酸序列是權利要求1中序列如SEQ?ID?NO.5所示的氨基酸序列，第601位及其之后的氨基酸序列為SEQ?ID?NO.2所示的AAV-8型血清型衣殼蛋白序列第591位及其之后的氨基酸序列。
3.根據權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的由10個氨基酸構成的多肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。
4.一種核酸，其特征在于，所述核酸的序列是下列中的任意一種：
5.一種AAV衣殼，其特征在于，含有權利要求1-3任意一項所述的多肽。
6.根據權利要求5所述的AAV衣殼，其特征在于，其構建方法包括如下步驟：
7.權利要求4所述的核酸的應用，其特征在于，所述的核酸在制備治療視網膜相關疾病藥物中的應用。
8.權利要求1-3任意一項所述的多肽的應用，其特征在于，所述的多肽在制備治療視網膜相關疾病藥物中的應用，所述的治療視網膜相關疾病藥物是靶向整體視網膜的藥物。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的治療視網膜相關疾病藥物是通過玻璃體注射，能夠提高視網膜整體感染效率、增加視網膜滲透效率的藥物或者提高視網膜識別效率的藥物。
10.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的細胞層中的細胞選自視網膜神經節分離細胞、Neuro2A細胞、U251細胞、ARPE-19細胞、SH-SY-5Y細胞、BV2細胞、HBMEC原代分離細胞、Jurkat細胞、K562細胞、293細胞或者THP1細胞中的一種或者多種。
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【技術特征摘要】
1.一種多肽，其特征在于，在如seq?id?no.2所示的aav-8型血清型衣殼蛋白的第590位氨基酸與第591位氨基酸之間插入由10個氨基酸構成的多肽，由10個氨基酸構成的多肽含有氨基酸序列如seq?id?no.5所示所述的多肽。
2.根據權利要求1所述的多肽，其特征在于，其第1—590位氨基酸序列如seq?id?no.2所示的aav-8型血清型衣殼蛋白序列的第1—590位氨基酸序列所示，第591—600位氨基酸中第593—599位氨基酸序列是權利要求1中序列如seq?id?no.5所示的氨基酸序列，第601位及其之后的氨基酸序列為seq?id?no.2所示的aav-8型血清型衣殼蛋白序列第591位及其之后的氨基酸序列。
3.根據權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的由10個氨基酸構成的多肽，其氨基酸序列如seq?id?no.3所示。
4.一種核酸，其特征在于，所述核酸的序列是下列中的任意一種：
5.一種aav衣殼，其特...
【專利技術屬性】
技術研發人員：顧莉萍，吳小江，張仕卿，廖曜琦，余虹，馬璐，
申請(專利權)人：上海目鏡生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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