【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種耐酸性的pet塑料降解酶petase突變體及其應(yīng)用，屬于生物酶工程。
技術(shù)介紹
1、聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene?terephthalate，pet)是一種人造聚合物，構(gòu)成了各種各樣的消費塑料。其突出的機(jī)械和化學(xué)穩(wěn)定性阻礙了其降解。塑料污染已被公認(rèn)為是對生物體構(gòu)成重大威脅的因素，最終會通過食物鏈累積，從而對人類健康產(chǎn)生負(fù)面影響。
2、目前，常用的降解pet塑料的方法包括物理法、化學(xué)法和生物法。物理回收導(dǎo)致pet分子鏈斷裂，分子量降低，存在難以去除的雜質(zhì)，從而顯著降低pet的性能和經(jīng)濟(jì)可行性。化學(xué)加工是能源密集型的，成本高，并可能產(chǎn)生有毒的二次污染物。與物理和化學(xué)方法處理pet相比，生物降解法環(huán)保且能耗低。因此，生物降解被認(rèn)為是最有效的pet降解方法。生物降解方法包括微生物降解和生物酶降解。由于pet結(jié)構(gòu)中含有芳香成分，不能直接進(jìn)入微生物細(xì)胞進(jìn)行生物降解。因此，首先需要微生物分泌的胞外酶將pet大分子聚合物降解為水溶性小分子，然后被微生物細(xì)胞吸收進(jìn)一步消化，最終水解為co2和h2o。pet生物降解的有效性主要依賴于這些細(xì)胞外酶的性能。因此，最有希望的選擇是pet酶促生物降解。近年來，一系列體外pet降解酶被報道主要針對pet酯鍵，將pet分解成更小的分子，如tpa、eg，單(2-羥乙基)對苯二甲酸酯(mhet)和雙(2-羥乙基)對苯二甲酸酯(bhet)。利用酶法在自然環(huán)境條件下對pet進(jìn)行生物降解是一種有希望的途徑，且具有一定的經(jīng)濟(jì)效益，可以減輕塑料廢物的全球負(fù)擔(dān)，從而限制其對環(huán)境和
3、經(jīng)過幾年的改進(jìn)，ispetase及其變體在達(dá)到100％底物轉(zhuǎn)化所需的長時間反應(yīng)中表現(xiàn)出活性下降，因此尚未滿足大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用的要求。hongyuan等人利用機(jī)器學(xué)習(xí)獲得了一株耐熱高活性的ispetase突變體，即fast-petase，在50℃和ph＝8.0條件下保持高活性。由于fast-petase能逐步將pet降解成雙(羥乙基)對苯二甲酸酯(bhet)、對苯二甲酸單(2-羥乙基)酯(mhet)和對苯二甲酸(tpa)，直接投入塑料薄片后，反應(yīng)液的ph值會有一定程度的降低，偏酸性條件下會使酶活性降低甚至失活。鑒于此，采用定點突變對fast-petase進(jìn)行耐酸性改造。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為解決上述問題，本專利技術(shù)提供了一種提高fast-petase耐酸性的酶突變體，單突變體r84d、r84e、r117d、r117e、k227d、k227e，雙突變體r84d/r117d、r84d/r117e、r84d/k227d、r84d/k227e、r84e/r117d、r84e/r117e、r84e/k227d、r84e/k227e、r117d/k227d、r117d/k227e、r117e/k227d、r117e/k227e。
2、本專利技術(shù)提供了一種耐酸性提高的fast-petase酶突變體，是在親本的基礎(chǔ)上進(jìn)行如下至少一種突變：
3、(1)將第84位精氨酸突變?yōu)樘於彼峄蚬劝彼幔?/p>
4、(2)將第117位精氨酸突變?yōu)樘於彼峄蚬劝彼幔?/p>
5、(3)將第227位賴氨酸突變?yōu)樘於彼峄蚬劝彼幔?/p>
6、(4)截短n端第1～21位氨基酸。
7、在一種實施方式中，所述突變體是在seq?id?no.1的基礎(chǔ)上，將第84位精氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?17位精氨酸突變?yōu)樘於彼幔@得的突變體命名為r84d/r117d。
8、在一種實施方式中，所述突變體是在seq?id?no.1的基礎(chǔ)上，將第84位精氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?17位精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔@得的突變體命名為r84d/r117e。
9、在一種實施方式中，所述突變體是在seq?id?no.1的基礎(chǔ)上，將第84位精氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?27位賴氨酸突變?yōu)樘於彼幔@得的突變體命名為r84d/k227d。
10、在一種實施方式中，所述突變體是在seq?id?no.1的基礎(chǔ)上，將第84位精氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?27位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼幔@得的突變體命名為r84d/k227e。
11、在一種實施方式中，所述突變體是在seq?id?no.1的基礎(chǔ)上，將第84位精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔瑢⒌?17位精氨酸突變?yōu)樘於彼幔@得的突變體命名為r84e/r117d。
12、在一種實施方式中，所述突變體是在seq?id?no.1的基礎(chǔ)上，將第84位精氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?17位精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔@得的突變體命名為r84e/r117e。
13、在一種實施方式中，所述突變體是在seq?id?no.1的基礎(chǔ)上，將第84位精氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?27位賴氨酸突變?yōu)樘於彼幔@得的突變體命名為r84e/k227d。
14、在一種實施方式中，所述突變體是在seq?id?no.1的基礎(chǔ)上，將第84位精氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?27位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼幔@得的突變體命名為r84e/k227e。
15、在一種實施方式中，所述突變體是在seq?id?no.1的基礎(chǔ)上，將第117位精氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?27位賴氨酸突變?yōu)樘於彼幔@得的突變體命名為r117d/k227d。
16、在一種實施方式中，所述突變體是在seq?id?no.1的基礎(chǔ)上，將第117位精氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?27位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼幔@得的突變體命名為r117d/k227e。
17、在一種實施方式中，所述突變體是在seq?id?no.1的基礎(chǔ)上，將第117位精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔瑢⒌?27位賴氨酸突變?yōu)樘於彼幔@得的突變體命名為r117e/k227d。
18、在一種實施方式中，所述突變體是在seq?id?no.1的基礎(chǔ)上，將第117位精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔瑢⒌?27位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼幔@得的突變體命名為r117e/k227e。
19、本專利技術(shù)還提供了編碼所述突變體的基因。
20、本專利技術(shù)還提供了攜帶所述基因的重組質(zhì)粒。
21、本專利技術(shù)還提供了表達(dá)所述突變體的重組微生物。
22、本專利技術(shù)還提供了一種重組大腸桿菌，以pet28a(+)為載體，以大腸桿菌bl21(de3)為宿主，表達(dá)所述突變體。
23、本專利技術(shù)還提供了制備所述fast-petase突變體的方法，是將所述重組大腸桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，用iptg誘導(dǎo)表達(dá)制備fast-petase突變體。
24、在一種實施方式中，所述方法是將所述重組大腸桿菌培養(yǎng)至od600＝0.6-0.8，加入終濃度0.4mm的iptg，16℃誘導(dǎo)表達(dá)24h。
25、本專利技術(shù)還提供了提高petase突變體耐酸性的方法，是將petase酶的第84位、第117位、第227位中的一個或多個氨基酸進(jìn)行突變。
26、在一種實施方式中，所述突變包括但不限于如下任一：r84d、r84e、本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種耐酸性提高的FAST-PETase酶突變體，其特征在于，是在親本的基礎(chǔ)上進(jìn)行如下至少一種改進(jìn)：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述親本的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述突變體的基因。
4.攜帶權(quán)利要求3所述基因的重組質(zhì)粒。
5.表達(dá)權(quán)利要求1或2所述突變體的重組微生物。
6.一種重組大腸桿菌，其特征在于，以pET28a(+)為載體，以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主，表達(dá)權(quán)利要求1或2所述突變體。
7.制備權(quán)利要求1或2所述FAST-PETase突變體的方法，其特征在于，將權(quán)利要求6所述重組大腸桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)FAST-PETase突變體。
8.一種提高PETase酶耐酸性的方法，其特征在于，將PETase酶的第84位、第117位、第227位中的一個或多個氨基酸進(jìn)行突變；所述PETase酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
9.權(quán)利要求1或2所述突變體在催化乙酸對硝基苯酯方面的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種耐酸性提高的fast-petase酶突變體，其特征在于，是在親本的基礎(chǔ)上進(jìn)行如下至少一種改進(jìn)：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述親本的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述突變體的基因。
4.攜帶權(quán)利要求3所述基因的重組質(zhì)粒。
5.表達(dá)權(quán)利要求1或2所述突變體的重組微生物。
6.一種重組大腸桿菌，其特征在于，以pet28a(+)為載體，以大腸桿菌bl21(de3)為宿主，表達(dá)權(quán)利要求1或2所述突變體。
7.制備權(quán)利要求1...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳獻(xiàn)忠，劉怡茹，吳愿，楊海泉，曹鈺，夏媛媛，沈微，周麗，
申請(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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