【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本申請涉及基因檢測，尤其涉及一種檢測非洲豬瘟病毒的組合物、試劑盒和方法。
技術介紹
1、非洲豬瘟病毒是一種豬烈性傳染病病毒，能引起豬的高熱、皮膚發(fā)紺以及淋巴結和內臟器官的嚴重出血等。非洲豬瘟病程短、死亡率高，被世界動物衛(wèi)生組織(worldorganization?for?animal?health，woah)列為法定通報的動物疫病。目前，對于非洲豬瘟的檢測包括病毒分離鑒定法；免疫學檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗；核酸檢測，包括常規(guī)的pcr技術和實時熒光定量pcr法等。其中，實時熒光定量pcr法可以快速對靶標進行檢測，也因其高靈敏度、精確性和重復性而備受青睞。該方法利用特異性引物和探針對dna進行檢測，在pcr擴增的過程中，熒光信號與pcr產(chǎn)物呈正比例關系，因此具有較高的檢測精度。
2、盡管實時熒光定量pcr法在非洲豬瘟病毒檢測中具有很高的潛力，但仍存在一些缺陷。特別是針對特定探針和引物，如現(xiàn)有常用的mgb探針，在非洲豬瘟病毒檢測中，存在背景信號干擾、靈敏度低和準確度不高等問題。這些問題限制了該方法的應用范圍和可靠性，使其在實際應用中面臨挑戰(zhàn)。
技術實現(xiàn)思路
1、本申請的目的在于提供一種檢測非洲豬瘟病毒的組合物、試劑盒和方法，旨在解決現(xiàn)有的mgb探針，在非洲豬瘟病毒檢測中，存在背景信號干擾、靈敏度低和準確度不高的問題。
2、為實現(xiàn)以上目的，本申請?zhí)峁┮环N組合物，包括引物組和探針；所述引物組用于擴增所述非洲豬瘟病毒b646l基因的特異性保守區(qū)域核酸序列，所述探針用
3、在一些實施例中，所述zipna探針的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
4、在一些實施例中，所述5'端熒光基團選自fam、vic、hex、rox、joe、tet、tamra、texsasred中的任一種，所述3'端淬滅基團選自bhq-1、bhq-2、eclipse、quencher中的任一種，所述精胺基團包括3-6個精胺單元，所述精胺基團設置在3'端；
5、優(yōu)選地，所述精胺基團包括4-5個精胺單元。
6、在一些實施例中，所述引物組包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述反向引物的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
7、本申請還提供一種試劑盒，包括上述的組合物。
8、在一些實施例中，所述試劑盒還包括pcr反應液和陽性標準品。
9、本申請還提供一種檢測非洲豬瘟病毒的方法，所述方法用于非疾病的診斷和治療，包括：
10、從待測樣品中提取核酸；
11、以所述核酸為模板，用上述的組合物或上述的試劑盒進行實時熒光定量pcr擴增反應，得到所述待測樣品對應的熒光信號；
12、根據(jù)所述待測樣品對應的熒光信號判定待測樣品中是否含有非洲豬瘟病毒。
13、在一些實施例中，還包括：
14、以不同濃度的陽性標準品為模板，用上述的組合物或上述的試劑盒進行實時熒光定量pcr擴增反應，得到不同濃度的陽性標準品的熒光信號，并根據(jù)不同濃度下的熒光信號建立標準曲線；
15、根據(jù)所述待測樣品對應的熒光信號與所述標準曲線，確定所述待測樣品中的非洲豬瘟病毒的濃度。
16、在一些實施例中，所述不同濃度的陽性標準品由陽性標準品梯度稀釋101至107倍得到，所述標準曲線的橫坐標為所述不同濃度的陽性標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值，縱坐標為所述實時熒光定量pcr擴增反應測得的ct值。
17、在一些實施例中，所述實時熒光定量pcr擴增反應的反應體系為：
18、2×qpcr?mix?udg，10μl；
19、正向引物10μm濃度，0.4μl；
20、反向引物10μm濃度，0.4μl；
21、zipna探針10μm濃度，0.2μl；
22、ddh2o，8μl；
23、dna樣本，1μl；
24、其中，dna樣本包括不同濃度的陽性標準品和待測樣品的核酸中的任一種。
25、與現(xiàn)有技術相比，本申請的有益效果包括：
26、本申請?zhí)峁┑慕M合物和試劑盒用于檢測非洲豬瘟病毒，包括引物組和探針，探針為zipna探針，所述zipna探針包括5'端熒光基團、3'端淬滅基團和精胺基團，該zipna探針可以提供更高的檢測特異性，因為它們可以更有效地減少非特異性結合和背景信號。zipna探針偶聯(lián)的陽離子，可中和靶核酸的負電荷，降低靜電排斥作用，同時，偶聯(lián)一定數(shù)量陽離子基團的zipna探針可達到預設的tm值。zipna探針可以有效替代小溝結合物和鎖核酸，可用于多種基于核酸檢測的應用領域。該zipna探針具有檢測熒光增量高、檢測特異性高、重復性好以及靈敏度高等優(yōu)勢，有利于實際應用。
27、本申請?zhí)峁┑臋z測非洲豬瘟病毒的方法使用本申請的組合物和試劑盒，檢測熒光增量高、檢測特異性高、重復性好以及靈敏度高。
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1.一種組合物，其特征在于，包括引物組和探針；所述引物組用于擴增所述非洲豬瘟病毒B646L基因的特異性保守區(qū)域核酸序列，所述探針用于檢測所述特異性保守區(qū)域核酸序列，所述探針為ZIPNA探針，所述ZIPNA探針包括5'端熒光基團、3'端淬滅基團和設置在5'端或3'端的精胺基團。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述ZIPNA探針的核苷酸序列如SEQ?IDNO.1所示。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的組合物，其特征在于，所述5'端熒光基團選自FAM、VIC、HEX、ROX、JOE、TET、TAMRA、TexsasRed中的任一種，所述3'端淬滅基團選自BHQ-1、BHQ-2、Eclipse、Quencher中的任一種，所述精胺基團包括3-6個精胺單元，所述精胺基團設置在3'端；
4.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述引物組包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ?IDNO.3所示。
5.一種試劑盒，其特征在于，包括權利要求1至4任一項所述的組合物。
6.根據(jù)權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR反應液和陽性標準品。
7.一種檢測非洲豬瘟病毒的方法，所述方法用于非疾病的診斷和治療，其特征在于，包括：
8.根據(jù)權利要求7所述的檢測非洲豬瘟病毒的方法，其特征在于，還包括：
9.根據(jù)權利要求8所述的檢測非洲豬瘟病毒的方法，其特征在于，所述不同濃度的陽性標準品由陽性標準品梯度稀釋101至107倍得到，所述標準曲線的橫坐標為所述不同濃度的陽性標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值，縱坐標為所述實時熒光定量PCR擴增反應測得的CT值。
10.根據(jù)權利要求8所述的檢測非洲豬瘟病毒的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR擴增反應的反應體系為：
...【技術特征摘要】
1.一種組合物，其特征在于，包括引物組和探針；所述引物組用于擴增所述非洲豬瘟病毒b646l基因的特異性保守區(qū)域核酸序列，所述探針用于檢測所述特異性保守區(qū)域核酸序列，所述探針為zipna探針，所述zipna探針包括5'端熒光基團、3'端淬滅基團和設置在5'端或3'端的精胺基團。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述zipna探針的核苷酸序列如seq?idno.1所示。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的組合物，其特征在于，所述5'端熒光基團選自fam、vic、hex、rox、joe、tet、tamra、texsasred中的任一種，所述3'端淬滅基團選自bhq-1、bhq-2、eclipse、quencher中的任一種，所述精胺基團包括3-6個精胺單元，所述精胺基團設置在3'端；
4.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述引物組包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：賈德臣，程壽玲，
申請(專利權)人：生工生物工程上海股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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