【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于魚類原始生殖細(xì)胞篩選，具體涉及一種用于篩選魚類pgc的重組基因序列及其構(gòu)建的載體和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、原始生殖細(xì)胞（primordial?germ?cell，pgc）是精子和卵子在胚胎期的祖細(xì)胞，是遺傳物質(zhì)代際傳遞的細(xì)胞載體。因此，pgc是開展基因編輯和轉(zhuǎn)基因等遺傳操作的理想靶細(xì)胞。然而，魚類胚胎中往往具有極少數(shù)目的pgc，比如1000-細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中僅有4顆pgc，嚴(yán)重限制了pgc的遺傳操作和研究。如何高效分離和富集魚類pgc是遺傳育種和生殖發(fā)育領(lǐng)域亟待解決的問題之一。
2、目前，魚類pgc富集的方法主要為人工挑選法和流式分選法。人工挑選法是先熒光標(biāo)記pgc的胚胎，通過酶解法分離成單個細(xì)胞，將細(xì)胞懸液最大量稀釋，然后基于熒光標(biāo)記富集pgc，在熒光顯微鏡下挑選出熒光陽性的pgc。這種方法雖然獲取的pgc純度高，且不依賴于流式細(xì)胞儀等大型儀器，但是pgc富集效率較極低，難以用于pgc遺傳操作研究。流式分選法是通過流式細(xì)胞儀將陽性細(xì)胞分選出來。這種方法分選效率相對較高，需要大約1小時左右。然而，pgc的純度相對較低，往往需要進(jìn)行多次流式分選。更重要的是，由于色素等細(xì)胞自發(fā)熒光導(dǎo)致僅通過熒光蛋白篩選很難將陽性pgc和陰性的自發(fā)熒光細(xì)胞區(qū)分開。
3、因此，亟需建立一種快速、高效的魚類pgc富集方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、鑒于此，本專利技術(shù)在原有綠色熒光蛋白（green?fluorescent?protein，gfp）標(biāo)記細(xì)胞的基礎(chǔ)上，同時采用了抗
2、為達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)目的之一在于提供一種用于篩選魚類pgc的重組基因序列，所述重組基因序列包括經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人cd4基因序列和pgc特異表達(dá)的 nanos3基因的 nanos33’utr序列，重組基因序列具體如seq?id?no.1所示。
4、本專利技術(shù)目的之二在于提供一種重組表達(dá)載體，所述重組載體含有上述的重組基因序列。
5、在一些具體實施例中，優(yōu)選的，所述重組表達(dá)載體的表達(dá)載體為pcs2+質(zhì)粒。
6、本專利技術(shù)目的之三在于提供一種重組基因工程菌，所述重組基因工程菌含有上述的重組表達(dá)載體。
7、本專利技術(shù)目的之四在于提供上述重組基因序列，和/或上述重組表達(dá)載體，和/或上述重組基因工程菌在篩選魚類pgc中的應(yīng)用。
8、進(jìn)一步的，所述應(yīng)用步驟具體如下：
9、s1、獲取人cd4基因序列，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，得到更適于魚類表達(dá)的hcd4基因，hcd4基因序列具體如seq?id?no.2所示；
10、s2、獲取pgc特異表達(dá)的 nanos3基因的 nanos33’utr序列，將hcd4基因序列和 nanos33’utr序列一同連接到表達(dá)載體pcs2+載體上，獲得pcs2+hcd4+utr nanos3質(zhì)粒；并進(jìn)一步通過體外轉(zhuǎn)錄獲取hcd4-utr nanos3mrna；
11、s3、將獲取的hcd4-utr nanos3mrna和魚類pgc特異標(biāo)記分子gfp-utr nanos3mrna混合后，顯微注射到1細(xì)胞期的魚類受精卵中，待胚胎發(fā)育后將胚胎分散成為單個細(xì)胞，并制成單細(xì)胞懸液；其中，gfp-utr nanos3序列如seq?id?no.3所示；
12、s4、將單細(xì)胞懸液與cd4抗體包被的磁珠混勻，孵育，利用磁力柱富集pgc，將富集前后的細(xì)胞懸液進(jìn)行熒光顯微鏡鏡檢，即可統(tǒng)計pgc占比。
13、在一些具體實施例中，優(yōu)選的，所述應(yīng)用過程中擴(kuò)增hcd4序列的引物如下：
14、正向引物：cgggatccatgaacagaggtgtgccttttag；
15、反向引物：ccgctcgagtcagtgtctacatctcacacaaaag。
16、在一些具體實施例中，優(yōu)選的，所述應(yīng)用過程中鑒定pcs2+hcd4+utr nanos3陽性菌落的引物如下：
17、上游檢測引物為：atttaggtgacactatagaatac；
18、下游檢測引物為：tcagtgtctacatctcac。
19、在一些具體實施例中，優(yōu)選的，步驟s4中單細(xì)胞懸液與cd4抗體包被的磁珠的體積比為10﹕1。
20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果為：
21、（1）本專利技術(shù)在原有綠色熒光蛋白（green?fluorescent?protein，gfp）標(biāo)記細(xì)胞的基礎(chǔ)上，同時采用了抗體標(biāo)記進(jìn)行篩選。相較于gfp，抗體標(biāo)記具有更高的特異性，可以排除自發(fā)熒光細(xì)胞干擾。
22、（2）抗體標(biāo)記進(jìn)行活細(xì)胞篩選需要抗體與活細(xì)胞表面抗原相結(jié)合，然而魚類pgc中尚未鑒定出適合活細(xì)胞分選的表面抗原；cd4是一種主要存在于輔助性t細(xì)胞（th細(xì)胞）表面的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，人cd4具有特異的抗體，可以應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞；本專利技術(shù)通過構(gòu)建魚類pgc特異表達(dá)人cd4表達(dá)載體pcs2+hcd4+utr nanos3，在魚類pgc細(xì)胞中特異表達(dá)hcd4，然后通過抗體標(biāo)記進(jìn)行活細(xì)胞分選和富集。
23、（3）為了擺脫對流式細(xì)胞分選等大型儀器設(shè)備的依賴，提高分選效率，本專利技術(shù)采用免疫磁珠法，通過hcd4抗原和抗體相結(jié)合，分選和富集魚類pgc，并通過gfp熒光進(jìn)行雙重篩選，極大提高了陽性細(xì)胞率和富集效率。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種用于篩選魚類PGC的重組基因序列，其特征在于，所述重組基因序列包括經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人CD4基因序列和PGC特異表達(dá)的nanos3基因的nanos3?3’UTR序列，重組基因序列具體如SEQ?ID?NO.1所示。
2.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組載體含有權(quán)利要求1所述的重組基因序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體的表達(dá)載體為pCS2+質(zhì)粒。
4.一種重組基因工程菌，其特征在于，所述重組基因工程菌含有權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求1所述重組基因序列，和/或權(quán)利要求2、3任一項所述重組表達(dá)載體，和/或權(quán)利要求4所述重組基因工程菌在篩選魚類PGC中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用步驟具體如下：
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用過程中擴(kuò)增hCD4序列的引物如下：
8.據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用過程中鑒定pCS2+hCD4+UTRnanos3陽性菌落的引物如下：
9
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于篩選魚類pgc的重組基因序列，其特征在于，所述重組基因序列包括經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人cd4基因序列和pgc特異表達(dá)的nanos3基因的nanos3?3’utr序列，重組基因序列具體如seq?id?no.1所示。
2.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組載體含有權(quán)利要求1所述的重組基因序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體的表達(dá)載體為pcs2+質(zhì)粒。
4.一種重組基因工程菌，其特征在于，所述重組基因工程菌含有權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王小四，孫永華，高霞霞，王厚鵬，何牡丹，葉鼎，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院水生生物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。