【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于植物基因工程，尤其涉及一種調控水稻抗病性基因ossk8及其編碼蛋白和應用。
技術介紹
1、水稻(oryza?sativa?l.)是世界上重要的糧食作物，在水稻的一生會遭受許多病害，其中由紋枯菌引起的真菌病害和白葉枯菌引起的細菌病害尤為嚴重，影響水稻的高產和穩產。紋枯病主要危害葉鞘和葉片，具有破壞性大、流行性強和寄主范圍廣等特點。白葉枯病主要由傷口或水孔入侵水稻葉片，可致水稻減產20-30％，嚴重時可達50％。
2、抗性基因介導的抗病育種被認為是當前農業生產上防控水稻病害的有效措施。盡管水稻轉基因育種技術因其周期短和效率高而被廣泛應用，已培育出多種抗病和高產的新品種，但由于抗紋枯病的基因資源相對匱乏，以及抗病機制研究的滯后，使得抗紋枯病的育種進展緩慢。因此，深入發掘新的水稻抗病基因對水稻抗病育種具有重要的應用價值，將為分子育種提供必要的基因資源和理論基礎，推動抗病新品種的開發和應用。
技術實現思路
1、專利技術目的：針對現有技術中存在的不足，本專利技術提供一種調控水稻抗病性基因ossk8，本專利技術鑒定了一個新的水稻抗性調控基因ossk8，通過對ossk8進行紋枯病和白葉枯病抗性鑒定及表達模式分析，發現過量表達基因ossk8會增強水稻對紋枯病和白葉枯病的抗性，而利用crispr/cas9基因編輯技術敲除該基因會降低水稻對這兩種病害的抗性。這表明ossk8正調控水稻對紋枯病和白葉枯病的抗性水平，因此在培育抗病水稻品種中具有較好的應用前景，對于提高水稻的抗病性和
2、本專利技術還提供所述水稻抗病性基因ossk8編碼的蛋白和應用。
3、技術方案：為了實現上述目的，本專利技術提供一種調控水稻抗病性基因，所述基因為ossk8基因，其序列如seq?id?no.1或者seq?id?no.2所示；或者與所述ossk8基因的核苷酸序列具有90％以上相似性，且可以調控水稻抗病性的基因的dna分子序列；或者可與ossk8基因的核苷酸序列雜交，且可以調控水稻抗病性的dna分子。
4、其中，seq?id?no.1和seq?id?no.2分別為ossk8基因的全長和cds序列，其中基因編輯敲除采用的全長序列，過表達采用的cds序列。
5、其中，所述抗病性為抗紋枯病和白葉枯病。
6、本專利技術所述調控水稻抗病性基因編碼的蛋白，所述蛋白由seq?id?no.2所編碼，其氨基酸序列如seq?id?no.3所示。
7、本專利技術含有所述的水稻抗紋枯病相關基因的過表達載體，所述過表達載體是將ossk8基因的cds序列進行擴增，連接到超表達載體pu1301，通過轉化，提取質粒，最終得到過表達載體。
8、本專利技術基于所述的水稻抗紋枯病相關基因的基因敲除載體，所述基因敲除載體包括靶序列和crispr/cas9載體；所述靶序列的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
9、本專利技術含有所述的過表達載體或者基因敲除載體的重組微生物或者轉基因植物細胞系。
10、其中，所述載體可為質粒、黏粒、噬菌體或病毒載體；所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌，如農桿菌；所述轉基因植物細胞系不包括繁殖材料。
11、本專利技術所述的調控水稻抗病性基因或者所述的調控水稻抗病性基因編碼的蛋白或者所述的過表達載體或者所述的基因敲除載體或者所述的重組微生物或者轉基因植物細胞系在調控水稻抗病性中應用。
12、其中，在水稻中過表達ossk8基因提高水稻紋枯病和白葉枯病抗性，而敲除ossk8基因降低水稻紋枯病和白葉枯病抗性。
13、本專利技術所述的調控水稻抗病性基因或者所述的調控水稻抗病性基因編碼的蛋白或者所述的過表達載體或者所述的基因敲除載體或者所述的重組微生物或者轉基因植物細胞系在培育增強抗紋枯病和白葉枯病水稻種質中的應用。
14、本專利技術所述的培育紋枯病和白葉枯病抗性提高/降低的轉基因水稻的方法，包括增強/降低受體水稻中ossk8基因編碼蛋白質的表達量和/或活性，得到轉基因水稻，所述轉基因水稻的抗病性高于/低于所述受體水稻。
15、其中，所述轉基因水稻的抗病性高于/低于所述受體水稻體現在轉基因水稻的紋枯病病斑長度低于/高于受體水稻以及白葉枯病病斑面積低于/高于受體水稻。
16、其中，所述增強或降低受體水稻中ossk8蛋白質的表達量和/或活性的方法是通過對所述受體水稻中ossk8蛋白質的編碼基因進行過表達或敲除來實現的。
17、進一步地，本專利技術所述的培育紋枯病和白葉枯病抗性降低/提高的轉基因水稻的方法在創制水稻抗病性新種質中的應用。
18、本專利技術中上述所述水稻品種具體可為中花11(zh11)。
19、本專利技術通過反向遺傳學鑒定到一個基因ossk8(loc_os11g48030)，編碼skp1類蛋白(oryza?skp1-like?protein,osk)，其位于第11染色體上，全長3198bp，有2個內含子，其中編碼序列(coding?sequence,cds)編碼124個氨基酸。紋枯病抗性鑒定結果表明，ossk8正調控水稻對紋枯病的抗性，即敲除ossk8基因會降低水稻對紋枯病的抗性，而過表達ossk8則顯著增強水稻紋枯病抗性。白葉枯病抗性鑒定結果表明，ossk8正調控水稻對白葉枯病的抗性，即敲除ossk8基因會降低水稻對白葉枯病的抗性，而過表達ossk8則顯著提高水稻白葉枯病抗性。這些結果表明，ossk8作為正調控基因，在水稻抗病分子育種中有重要的應用潛力。
20、本專利技術所述應用中所述抗病性可為紋枯病抗性和/或白葉枯病抗性；所述調控具體體現在：當植物中的ossk8蛋白的活性和/或含量降低時，所述植物對紋枯病和白葉枯病的抗性降低；當植物中的ossk8蛋白的活性和/或含量提高時，所述植物對紋枯病和白葉枯病的抗性提高。其中，所述植物育種具體可為創制水稻紋枯病抗性新種質和水稻白葉枯病抗性新種質。
21、上述方法中，所述降低受體水稻中的ossk8基因表達量和/或活性的主要步驟如下：(1)目的基因片段的獲得。在本專利技術中，所有候選基因的目的片段均通過pcr技術擴增自中花11的cdna對應的基因。(2)將目的基因片段連接至中間(克隆)載體per8-cas9-u3/u6；(3)挑選陽性克隆并測序證實；陽性克隆質粒和終載體質粒混合進行重組反應；(4)pcr及質粒酶切驗證陽性克隆；(5)重組型陽性質粒轉入農桿菌；(6)陽性農桿菌單克隆的驗證和保存。在實驗操作過程中，總rna的提取選自4-5葉期的中花11幼苗整株組織(以葉片為株)，按照trizol法(invitrogen公司)進行；總cdna的合成使用primescript?rt?reagent?kitwith?gdnaeraser試劑盒(takara公司)進行；重組質粒的提取使用e.z.n.a.tm?plasmidmidi?kit試劑盒(omega公司)進行。增強受體水稻中的ossk8基因表達量和/或活性是采用高本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種調控水稻抗病性基因，其特征在于，所述基因為OsSK8基因，其序列如SEQ?IDNO.1或者SEQ?ID?NO.2所示；或者與所述OsSK8基因的核苷酸序列具有90％以上相似性，且可以調控水稻抗病性的基因的DNA分子序列；或者可與OsSK8基因的核苷酸序列雜交，且可以調控水稻抗病性的DNA分子。
2.根據權利要求1所述的調控水稻抗病性基因，其特征在于，所述抗病性優選為抗紋枯病和白葉枯病。
3.一種權利要求1所述調控水稻抗病性基因編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白由SEQID?NO.2所編碼，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。
4.一種含有權利要求1所述的水稻抗紋枯病相關基因的過表達載體，其特征在于，所述過表達載體是將OsSK8基因的CDS序列進行擴增，連接到超表達載體pU1301，通過轉化，提取質粒，最終得到過表達載體。
5.一種基于權利要求1所述的水稻抗紋枯病相關基因的基因敲除載體，其特征在于，所述基因敲除載體包括靶序列和CRISPR/Cas9載體；所述靶序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。
6.
7.一種權利要求1所述的調控水稻抗病性基因或者權利要求2所述的調控水稻抗病性基因編碼的蛋白或者權利要求4所述的過表達載體或者權利要求5所述的基因敲除載體或者權利要求6所述的重組微生物或者轉基因植物細胞系在調控水稻抗病性中應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，在水稻中過表達OsSK8基因提高水稻紋枯病和白葉枯病抗性，而敲除OsSK8基因降低水稻紋枯病和白葉枯病抗性。
9.一種權利要求1所述的調控水稻抗病性基因或者權利要求2所述的調控水稻抗病性基因編碼的蛋白或者權利要求4所述的過表達載體或者權利要求5所述的基因敲除載體或者權利要求6所述的重組微生物或者轉基因植物細胞系在培育增強抗紋枯病和白葉枯病水稻種質中的應用。
10.一種培育紋枯病和白葉枯病抗性提高/降低的轉基因水稻的方法，包括增強/降低受體水稻中OsSK8基因編碼蛋白質的表達量和/或活性，得到轉基因水稻，所述轉基因水稻的抗病性高于/低于所述受體水稻。
...【技術特征摘要】
1.一種調控水稻抗病性基因，其特征在于，所述基因為ossk8基因，其序列如seq?idno.1或者seq?id?no.2所示；或者與所述ossk8基因的核苷酸序列具有90％以上相似性，且可以調控水稻抗病性的基因的dna分子序列；或者可與ossk8基因的核苷酸序列雜交，且可以調控水稻抗病性的dna分子。
2.根據權利要求1所述的調控水稻抗病性基因，其特征在于，所述抗病性優選為抗紋枯病和白葉枯病。
3.一種權利要求1所述調控水稻抗病性基因編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白由seqid?no.2所編碼，其氨基酸序列如seq?id?no.3所示。
4.一種含有權利要求1所述的水稻抗紋枯病相關基因的過表達載體，其特征在于，所述過表達載體是將ossk8基因的cds序列進行擴增，連接到超表達載體pu1301，通過轉化，提取質粒，最終得到過表達載體。
5.一種基于權利要求1所述的水稻抗紋枯病相關基因的基因敲除載體，其特征在于，所述基因敲除載體包括靶序列和crispr/cas9載體；所述靶序列的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
【專利技術屬性】
技術研發人員：胡珂鳴，王加豪，吳邊，游艾青，何予卿，董振中，左示敏，周雷，
申請(專利權)人：揚州大學，
類型：發明
國別省市：
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