【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及免疫檢測，尤其涉及一種抗人磷酸化tau181兔單克隆抗體、抗人磷酸化tau217兔單克隆抗體、制備方法及聯合檢測應用。
技術介紹
1、阿爾茨海默癥(ad，alzhemierdisease)是一種腦神經退行性疾病，俗稱老年癡呆。其主要癥狀有兩個：一是β-淀粉樣蛋白在神經元細胞外異常沉積形成的老年斑，二是tau蛋白的異常磷酸化所形成的nfts(神經元纖維纏結)。ad患者腦中存在大量異常tau蛋白，tau蛋白異常修飾、含量變化對臨床ad病理發生有重要作用。tau蛋白是人體第17號染色體編碼的蛋白，在神經系統該蛋白是組成微管的主要成分。最近有研究表明tau蛋白的異常磷酸化所導致的聚集同ad的有很高的相關性。
2、當前，針對ad患者血漿與腦脊液(csf)中tau蛋白的檢測，已發展出多種免疫方法，其中單克隆抗體是此類檢測技術的核心組件。這些抗體需具備高度特異性，以準確識別磷酸化的tau蛋白。值得注意的是，多項研究揭示，血漿中的磷酸化tau蛋白，尤其是p-tau181、p-tau217和p-tau231，展現出對阿爾茨海默癥出色的診斷準確性，其性能與csf及神經影像學標志物相當，為血液檢測在ad診斷中的應用開辟了新途徑。《中國阿爾茨海默病癡呆診療指南(2020年版)》更是明確將p-tau181和p-tau217作為區分ad與非ad癡呆的重要生物標志物。
3、然而，盡管現有技術已能通過如elisa等免疫檢測技術實現磷酸化tau蛋白的檢測，但現有技術所制備的抗體在檢測時存在檢測的準確性與靈敏度較低的問題。p>
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種抗人磷酸化tau181兔單克隆抗體、抗人磷酸化tau217兔單克隆抗體、制備方法及聯合檢測應用，旨在解決現有技術中所制備的抗體在檢測時存在檢測的準確性與靈敏度較低的技術問題。
2、為實現上述目的，本專利技術采用的一種制備方法，包括如下步驟：
3、選取全長人tau蛋白抗原、p-tau181多肽抗原以及p-tau217多肽抗原備用；
4、將全長人tau蛋白抗原、p-tau181多肽抗原以及p-tau217多肽抗原分別與完全弗氏佐劑混合乳化，采用皮下注射方法免疫新西蘭兔；
5、用采血管分別取三種抗原的兔外周血40ml/只，將外周血與等量的pbs混勻后緩慢加入到淋巴細胞分離液上方，室溫400×g離心30分鐘，然后吸取單個核細胞層，用pbs洗滌去除血小板和淋巴細胞分離液后即可獲得三種抗原的兔pbmc細胞s；
6、將上述三種抗原(ag)分別用af488熒光預先標記；分別取5x107上述兔pbmcs細胞與生物素標記羊抗兔cd4、cd8、igm反應15分鐘，通過磁珠分選法用streptavidin預偶聯磁珠去除cd4+、cd8+、igm+細胞群，將收集的細胞再與對應的熒光標記的抗原、熒光標記的羊抗兔igg-af647反應15分鐘，洗滌細胞后，最后加入7-aad反應；采用流式分選法，分選出7-aad-、ag+、igg+的細胞群；
7、選用單細胞測序法，將上述收集的7-aad-、ag+、igg+細胞群，采用單細胞免疫組庫5’建庫流程，以104細胞數分別上樣，分別建立vdj庫、基因表達庫，經過pe150二代測序后，通過生信分析流程，初篩出重輕鏈配對的vdj基因；合成基因并構建質粒載體，用48孔板分別轉染hek293細胞進行表達，通過間接elisa法最終確定陽性克??；最終獲得的陽性克隆如下：
8、p-tau181陽性克隆：g69、g92；
9、p-tau217陽性克?。篻32、g95、g122；
10、total-tau陽性克隆：g70、g75；
11、將陽性克隆的質粒載體擴大轉染生產規模的hek293細胞，轉染細胞培養120-144小時后，收取細胞懸液，離心取上清，通過proteina親和層析法進行抗體純化即可獲得抗人磷酸化tau181與tau217兔單克隆抗體。
12、其中，全長人tau蛋白抗原的制備方法如下：
13、合成人tau(2n4r)蛋白全長基因序列，通過瞬時轉染hek293細胞進行表達，轉染細胞培養144小時后，收取細胞上清，然后通過his標簽純化獲得全長人tau蛋白。
14、如上述所述的抗人磷酸化tau181兔單克隆抗體與抗人磷酸化tau217兔單克隆抗體的聯合檢測應用，
15、采用抗人磷酸化tau181與tau217兔單克隆抗體制備檢測人磷酸化tau蛋白的免疫檢測產品；
16、所述免疫檢測產品為檢測試劑盒或檢測試紙條或作為免疫檢測試劑的原材料。
17、其中，所述檢測試劑盒為雙抗體夾心elisa檢測試劑盒或化學發光免疫檢測試劑盒。
18、本專利技術還提供一種p-tau181兔單克隆抗體，采用如上述所述的制備方法制備而成，所述p-tau181兔單克隆抗體包括第一重鏈可變區vh序列和第一輕鏈可變區vl序列，所述第一重鏈可變區vh序列如seq?id?no1所示，所述第一輕鏈可變區vl序列如seq?id?no2所示；
19、所述第一重鏈可變區vh序列包括三個重鏈cdr區序列，分別為hcdr1-3，序列如seqid?no3-5所示；
20、所述第一輕鏈可變區vl序列包括，包含三個輕鏈cdr區序列，分別為lcdr1-3，序列如seq?id?no6-8所示。
21、seq?id?no1:
22、qsleesggdlvkpgasltltctasgfdlnsnywmswvrqapgkglewiacivtddgrlyytwakgrftisktssttvtlqmtgltaadtatyfcvrwydlwgpgtlvtvss
23、seq?id?no2:
24、aqvltqtpspvsaavggtvsiscqssesvysknwlswyqqkpgqppklliyeasklssgvpsrfkgsgsgtqftltisdvqcddaatyycaggynrysdtygfgggtevvvk
25、seq?id?no3:
26、gfdlnsnyw
27、seq?id?no4:
28、ivtddgr
29、seq?id?no5:
30、vrwydl
31、seq?id?no6:
32、esvysknw
33、seq?id?no7:
34、eas
35、seq?id?no8:
36、aggynrysdtyg
37、其中，編碼第一重鏈可變區vh與第一輕鏈可變區vl的第一核酸序列，序列如seqid?no9-10所示。
38、seq?id?no9:
39、cagtcgttggaggagtccgggggagacctggtcaagcctggggcatccctgacac本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種制備方法，其特征在于，
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，
3.一種抗人磷酸化Tau181兔單克隆抗體，采用如權利要求2所述的制備方法制備而成，其特征在于，
4.如權利要求3所述的抗人磷酸化Tau181兔單克隆抗體，其特征在于，
5.一種抗人磷酸化Tau217兔單克隆抗體，采用如權利要求2所述的制備方法制備而成，其特征在于，
6.如權利要求5所述的抗人磷酸化Tau217兔單克隆抗體，其特征在于，
7.如權利要求2所述的制備方法所制備的抗人磷酸化Tau181兔單克隆抗體與抗人磷酸化Tau217兔單克隆抗體的聯合檢測應用，其特征在于，
8.如權利要求7所述的聯合檢測應用，其特征在于，
9.如權利要求8所述的聯合檢測應用，其特征在于，
【技術特征摘要】
1.一種制備方法，其特征在于，
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，
3.一種抗人磷酸化tau181兔單克隆抗體，采用如權利要求2所述的制備方法制備而成，其特征在于，
4.如權利要求3所述的抗人磷酸化tau181兔單克隆抗體，其特征在于，
5.一種抗人磷酸化tau217兔單克隆抗體，采用如權利要求2所述的制備方法制備而...
【專利技術屬性】
技術研發人員：林世康，李菁，王鳳娟，高坤，岳明，
申請(專利權)人：南京川博生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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