【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及動物疫苗，更具體而言，涉及一種重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白及其制備方法與應用。
技術介紹
1、豬流行性腹瀉（porcine?epidemic?diarrhea，ped）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine?epidemic?diarrhea?virus，pedv）引起的一種高度傳染性的急性腸道疾病。該病發病急且迅速，伴有嚴重腹瀉、嘔吐和脫水等臨床癥狀。pedv可以感染所有年齡的豬，特別是對哺乳仔豬可造成近百分之百的死亡率，給養豬行業造成了重大的經濟損失。
2、pedv是一種有包膜的單鏈正鏈rna病毒，屬于冠狀病毒科的甲型冠狀病毒屬。pedv基因組長度約為28kb，編碼多種非結構復制酶蛋白和四種主要結構蛋白，包括刺突蛋白（spike，s）、包膜蛋白（envelope，e）、膜蛋白（membrane，m）和核衣殼蛋白（nucleocapsid，n）以及s和e之間的輔助開放閱讀框3（orf3）。pedv的s蛋白分為兩個亞基s1和s2，其中s1位于病毒表面，主要作用在于識別受體與宿主細胞受體相結合，并介導中和抗體的產生。s2主要負責病毒囊膜與宿主細胞膜的融合，并將病毒rna導入宿主細胞內，從而引起細胞的感染。因此，對pedv?s蛋白的正確表達和充分的糖基化修飾，是開發基因工程亞單位疫苗的重大挑戰。
3、國內市場上用于控制、預防pedv的疫苗基本都是pedv弱毒活疫苗和滅活疫苗。盡管滅活疫苗具有多種優勢，如良好的安全性。然而，滅活疫苗的免疫原性可能會在滅活過程中受到破壞。減毒活疫苗具
4、基于對冠狀病毒的結構和功能認知，推進了腹瀉s蛋白的基礎研究。盡管s蛋白通過c端序列的相互纏繞，從而形成三聚體，但目前的認識普遍認為，n端（s1）部分才是關鍵抗原區域。因此對s1的正確表達以及在此基礎上形成類病毒顆粒（vlp），可能獲得較好的免疫原性。
5、轉鐵蛋白可自發形成24聚體，在24聚體表面展示s1蛋白，有可能提高免疫原性。基于此假設，本專利技術為此進行了進一步的研究，并驗證其在動物中的免疫原性。
技術實現思路
1、本專利技術旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一，為此，本專利技術的一個方面的目的在于，提供一種重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白，所述重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白基酸序列來源于豬流行性腹瀉病毒s蛋白的s1亞基（s蛋白全長由本實驗分離并基因測序，ncbi登錄號：pp083729.1，s1部分氨基酸序列為1-734，（seq?id?no.1）、信號肽氨基酸序列（seq?id?no.2）、6*his標簽序列（seqid?no.3）、linker序列（seq?idno.4）和spytag序列（seq?id?no.5，參考pdb號：4mli_b），重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白（s1-c-s）的氨基酸序列為seq?id?no.6；所述轉鐵蛋白融合蛋白氨基酸序列來源于helicobacter?pylori（seq?id?no.8，參考uniprot：q9zli1），enterokinase?site序列（seqid?no.9），linker序列（seq?id?no.10），spycatcher序列（seq?id?no.11，參考genebank登陸號：qgx07219.1），轉鐵蛋白融合蛋白的氨基酸序列為seq?id?no.12。
2、優選的，所述重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白的編碼核酸，依據密碼子規則可得到，可依據宿主細胞的偏好性進行密碼子優化。優選的核苷酸的序列如seq?id?no.7所示。
3、優選的，所述重組轉鐵蛋白（spycatcher-ferritin）的編碼核酸，依據密碼子規則可得到，可依據宿主細胞的偏好性進行密碼子優化；優選的核苷酸的序列如seq?id?no.13所示。
4、本專利技術的另一個方面的目的在于，提供一種重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白的制備方法，所述制備方法具體步驟如下：
5、s1.將重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白的編碼基因克隆到表達載體pcdna3.1上，得到重組表達載體pcdna3.1-s1-c-s，將重組表達載體pcdna3.1-s1-c-s通過化學轉染試劑瞬轉入真核細胞中，培養離心收集細胞上清液，使用博格隆5ml鎳柱進行純化，得到重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白（s1-c-s）；
6、s2.將轉鐵蛋白的編碼核酸克隆到表達載體pet21a上，得到重組表達載體pet21a-spycatcher-ferritin，將重組表達載體pet21a-spycatcher-ferritin轉化到大腸桿菌宿主細胞，得到重組基因工程菌，進行誘導表達后離心收集菌泥，重懸后超聲破碎，離心取上清液，使用博格隆5ml鎳柱進行純化，得到重組轉鐵蛋白（spycatcher-ferritin）；
7、s3.將重組轉鐵蛋白spycatcher-ferritin和重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白（s1-c-s）按摩爾比進行配制，配制完成后混勻，置于25±2℃，組裝6-8h，制備得到重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白s1-f-vlp。
8、優選的，所述s1中重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白的編碼核酸序列為seq?id?no.7。
9、優選的，所述s1中重組表達載體為pcdna3.1、pee17或pks001，轉染試劑為pei，真核細胞為hek293細胞或cho細胞，培養時間為5-16天。
10、優選的，所述s1中離心條件為先4℃，1000rpm離心10min，再4℃，8000rpm離心30min。
11、優選的，所述s2中重組轉鐵蛋白的編碼核酸序列本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種重組豬流行性腹瀉病毒S1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白，其特征在于：所述重組豬流行性腹瀉病毒S1蛋白氨基酸序列來源于豬流行性腹瀉病毒S蛋白的S1亞基、信號肽氨基酸序列、6*His標簽序列、Linker序列和SpyTag序列，重組豬流行性腹瀉病毒S1蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?No.6；所述轉鐵蛋白融合蛋白氨基酸序列來源于幽門螺旋桿菌，Enterokinase?Site序列，SpyCatcher序列，轉鐵蛋白融合蛋白的氨基酸序列為SEQ?IDNo.12。
2.根據權利要求1所述的一種重組豬流行性腹瀉病毒S1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述制備方法具體步驟如下：
3.根據權利要求2所述的一種重組豬流行性腹瀉病毒S1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述S1中重組豬流行性腹瀉病毒S1蛋白的編碼核酸序列為SEQ?IDNo.7。
4.根據權利要求2所述的一種重組豬流行性腹瀉病毒S1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述S1中重組表達載體為pcDNA3.1、pEE17或pks001，轉染試劑為PEI，真核細胞為
5.根據權利要求2所述的一種重組豬流行性腹瀉病毒S1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述S1中離心條件為先4℃，1000rpm離心10min，再4℃，8000rpm離心30min。
6.根據權利要求2所述的一種重組豬流行性腹瀉病毒S1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述S2中重組轉鐵蛋白的編碼核酸序列為SEQ?ID?No.13；所述表達載體為大腸桿菌表達載體。
7.根據權利要求2所述的一種重組豬流行性腹瀉病毒S1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述S3中摩爾比為1-5:1-5，溫度為25℃，組裝時間為6h。
8.根據權利要求1所述的一種重組豬流行性腹瀉病毒S1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白的應用，其特征在于：所述重組豬流行性腹瀉病毒S1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白作為亞單位疫苗在動物疫苗領域的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白，其特征在于：所述重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白氨基酸序列來源于豬流行性腹瀉病毒s蛋白的s1亞基、信號肽氨基酸序列、6*his標簽序列、linker序列和spytag序列，重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白的氨基酸序列為seq?id?no.6；所述轉鐵蛋白融合蛋白氨基酸序列來源于幽門螺旋桿菌，enterokinase?site序列，spycatcher序列，轉鐵蛋白融合蛋白的氨基酸序列為seq?idno.12。
2.根據權利要求1所述的一種重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述制備方法具體步驟如下：
3.根據權利要求2所述的一種重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述s1中重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白的編碼核酸序列為seq?idno.7。
4.根據權利要求2所述的一種重組豬流行性腹瀉病毒s1蛋白和轉鐵蛋白融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述s1中重組表達...
【專利技術屬性】
技術研發人員：程家海，胡莉紅，趙明治，李志強，康朵，
申請(專利權)人：金宇保靈生物藥品有限公司，
類型：發明
國別省市：
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