【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及血藥濃度檢測(cè)，具體涉及用于檢測(cè)單抗藥物和抗單抗藥物抗體的試劑和方法。
技術(shù)介紹
1、大分子單抗藥物，全稱(chēng)為大分子單克隆抗體藥物（macromolecular?monoclonalantibody，mab），是一類(lèi)由生物工程技術(shù)制備的、具有高度特異性和親和力的蛋白質(zhì)類(lèi)藥物。它們?cè)从趩慰寺】贵w技術(shù)，通過(guò)特定的免疫過(guò)程，在實(shí)驗(yàn)室條件下刺激b淋巴細(xì)胞產(chǎn)生只針對(duì)單一抗原表位的抗體，然后利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量生產(chǎn)這種抗體，進(jìn)而經(jīng)過(guò)純化等工藝制備成藥物。
2、這類(lèi)藥物的特點(diǎn)是分子量大（約150kda左右），結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由兩條重鏈和兩條輕鏈通過(guò)二硫鍵連接形成“y”形結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)使得單抗藥物能夠精確地識(shí)別并結(jié)合到特定的靶標(biāo)分子上，如細(xì)胞膜上的受體、細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子或細(xì)胞外的病原體等。
3、大分子單抗藥物具有明確的靶標(biāo)和特異性的作用機(jī)制，具有更好的安全性和有效性。但它們也可能被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別為異物，從而引發(fā)不良的免疫反應(yīng)。主要表現(xiàn)之一就是抗藥物抗體（anti-drug?antibodies，adas）的產(chǎn)生。ada能夠與mab相互作用，影響其藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)特性，降低其療效。一方面，如果ada導(dǎo)向至抗原結(jié)合位點(diǎn)，則mab-ada復(fù)合物將不具有生物活性，從而導(dǎo)致mab的藥效學(xué)特性改變；另一方面，mab和ada之間形成的免疫復(fù)合物的大小和組成有所不同，這會(huì)加速肝和脾捕獲它們并激活免疫系統(tǒng)和刺激藥物清除。由于這些原因，adas可引起藥物原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥性，影響治療效果。
4、現(xiàn)有技術(shù)cn?11102495
5、現(xiàn)有技術(shù)cn114740195a公開(kāi)了一種阿達(dá)木單抗藥的ada即時(shí)檢測(cè)試紙條和試劑盒，該專(zhuān)利未披露任何藥物耐受和靶標(biāo)耐受信息。
6、現(xiàn)有技術(shù)cn106164670a公開(kāi)了一種用于檢測(cè)抗藥物抗體的存在或抗藥物抗體的量的測(cè)定，需要復(fù)雜的操作步驟，采取過(guò)夜沉淀，不利于自動(dòng)化，通量較低且成本高，無(wú)法滿足臨床廣泛快速的需求。
7、現(xiàn)有技術(shù)cn?118792260?a提供了一種雜交瘤細(xì)胞株tna1-6c3、單克隆抗體、試劑盒和應(yīng)用，雜交瘤細(xì)胞株（mus?musculus）tna1-6c3保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.46006，該專(zhuān)利技術(shù)所述雜交瘤細(xì)胞株tna1-6c3生產(chǎn)的單克隆抗體tna1-6c3能夠?qū)崿F(xiàn)抗阿達(dá)木藥物抗體的高效監(jiān)測(cè)，抗干擾能力強(qiáng)，特異性高，靈敏度高，簡(jiǎn)單快速且自動(dòng)化程度高。但該現(xiàn)有技術(shù)中采用了融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)fab結(jié)構(gòu)，原因是fab結(jié)構(gòu)可標(biāo)記性差，只能采用融合蛋白的形式來(lái)表達(dá)，因此，該現(xiàn)有技術(shù)的方法通用性不強(qiáng)。
8、目前同時(shí)對(duì)大分子單抗藥物（macromolecular?monoclonal?antibody，mab）與抗藥物抗體（anti-drug?antibodies，adas）進(jìn)行定量檢測(cè)的技術(shù)存在以下難點(diǎn)：
9、（1）兩種檢測(cè)試劑內(nèi)的抗體能夠發(fā)生相互反應(yīng)，無(wú)法在一個(gè)反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)聯(lián)檢。
10、（2）試劑倉(cāng)的限制，即試劑數(shù)量大于試劑倉(cāng)數(shù)量，導(dǎo)致裝載體無(wú)法承載兩套試劑。
11、（3）質(zhì)譜一直是治療藥物監(jiān)測(cè)的常用技術(shù)手段，但其硬件的局限性，無(wú)法對(duì)大分子物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。
12、因此，市面上尚未有可以同時(shí)進(jìn)行大分子單抗藥物（mab）與抗藥物抗體（adas）進(jìn)行定量檢測(cè)的技術(shù)或產(chǎn)品，屬于市場(chǎng)空白。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種同時(shí)對(duì)大分子單抗藥物（macromolecularmonoclonal?antibody，mab）與抗藥物抗體（anti-drug?antibodies，adas）進(jìn)行定量檢測(cè)的試劑及其應(yīng)用。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專(zhuān)利技術(shù)采用如下的技術(shù)方案：
3、用于檢測(cè)單抗藥物和抗單抗藥物抗體的試劑，包括c試劑和d試劑，所述c試劑包括鼠抗f(ab)2單克隆抗體-1偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物和鼠抗f(ab)2單克隆抗體-2偶聯(lián)生物素；所述d試劑包括大分子單抗藥物偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物和f(ab)2偶聯(lián)生物素；
4、鼠抗f(ab)2單克隆抗體-1偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物和大分子單抗藥物偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物是采用發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的鼠抗f(ab)2單克隆抗體-1和大分子單抗藥物；
5、鼠抗f(ab)2單克隆抗體-2偶聯(lián)生物素或f(ab)2偶聯(lián)生物素是采用生物素偶聯(lián)的鼠抗f(ab)2單克隆抗體-2和f(ab)2；
6、鼠抗f(ab)2單克隆抗體-1、鼠抗f(ab)2單克隆抗體-2是將f(ab)2導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，制備f(ab)2免疫小鼠，并將f(ab)2免疫小鼠的脾細(xì)胞與?sp/20細(xì)胞融合后，篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗?f(ab)2單克隆抗體-1與抗?f(ab)2單克隆抗體-2的兩種單克隆細(xì)胞株，并通過(guò)細(xì)胞株分泌得到；所述鼠抗f(ab)2單克隆抗體-1、鼠抗f(ab)2單克隆抗體-2可以同時(shí)與f(ab)2發(fā)生特異性結(jié)合作用，形成抗體-抗原-抗體三明治夾心結(jié)構(gòu)。
7、f(ab)2是由胃蛋白酶消化整個(gè)?igg?抗體（結(jié)構(gòu)如圖7所示），去除大部分?fc?區(qū)同時(shí)完整保留一些鉸鏈區(qū)后得到的。f(ab)2具有通過(guò)二硫鍵連接在一起的兩個(gè)抗原結(jié)合?f(ab)?部分，因此f(ab)2為雙價(jià)抗體，分子量為約110?kda。
8、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述發(fā)光標(biāo)記物為吖啶酯、魯米諾和異魯米諾中的任意一種。
9、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，鼠抗f(ab)2單克隆抗體-1偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物或大分子單抗藥物偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物的制備過(guò)程包括以下步驟：
10、s1、抗體活化：用標(biāo)記緩沖液將鼠抗f(ab)2單克隆抗體-1或大分子單抗藥物配置成濃度為0.2-0.5ml/ml的溶液，靜置；
11、s2、將活化后抗體和發(fā)光標(biāo)記物按照體積比15-25:1在室溫下避光偶聯(lián)0.5-1.5h；純化，得到鼠抗f(ab)2單克隆抗體-1偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物或大分子單抗藥物偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物；
12、發(fā)光標(biāo)記物的濃度為0.2-0.5mg/ml。
13、如無(wú)特別說(shuō)明，本專(zhuān)利技術(shù)中的室溫為15-25℃。
14、在其中一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，按重量份計(jì)，標(biāo)記緩沖液包括：2-4份kh2po4、25-39份na2hpo4·12h2o、60-100份nacl、2-4份kcl和780-820份超純水本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.用于檢測(cè)單抗藥物和抗單抗藥物抗體的試劑，其特征在于，包括C試劑和D試劑，所述C試劑包括鼠抗F(ab)2單克隆抗體-1偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物和鼠抗F(ab)2單克隆抗體-2偶聯(lián)生物素；所述D試劑包括大分子單抗藥物偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物和F(ab)2偶聯(lián)生物素；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述發(fā)光標(biāo)記物為吖啶酯、魯米諾和異魯米諾中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，鼠抗F(ab)2單克隆抗體-1偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物或大分子單抗藥物偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物的制備過(guò)程包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述生物素為Biotin、Desthiobiotin、水飛薊賓-生物素和生物素-香豆素中的任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，鼠抗F(ab)2單克隆抗體-2偶聯(lián)生物素或F(ab)2偶聯(lián)生物素的制備過(guò)程包括以下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，在試劑中，鼠抗F(ab)2單克隆抗體-1偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物、鼠抗F(ab)2單克隆抗體-2偶聯(lián)發(fā)光生物素等量，大分子單抗藥物偶聯(lián)發(fā)光
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征在于，所述大分子單抗藥物為貝伐珠、曲妥珠、信迪利、利妥昔或英夫利昔中的任意一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑，其特征在于，貝伐珠F(ab)2的重鏈基因序列如SEQ?IDNO.1所示，貝伐珠F(ab)2的輕鏈基因序列如SEQ?ID?NO.2所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征在于，所述用于檢測(cè)單抗藥物和抗單抗藥物抗體的試劑還包括A試劑和B試劑；所述A試劑為鏈霉親和素磁珠溶液；所述B試劑為樣本稀釋液。
...【技術(shù)特征摘要】
1.用于檢測(cè)單抗藥物和抗單抗藥物抗體的試劑，其特征在于，包括c試劑和d試劑，所述c試劑包括鼠抗f(ab)2單克隆抗體-1偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物和鼠抗f(ab)2單克隆抗體-2偶聯(lián)生物素；所述d試劑包括大分子單抗藥物偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物和f(ab)2偶聯(lián)生物素；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述發(fā)光標(biāo)記物為吖啶酯、魯米諾和異魯米諾中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，鼠抗f(ab)2單克隆抗體-1偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物或大分子單抗藥物偶聯(lián)發(fā)光標(biāo)記物的制備過(guò)程包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述生物素為biotin、desthiobiotin、水飛薊賓-生物素和生物素-香豆素中的任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，鼠抗f(ab)2單克隆抗體-2偶聯(lián)生物素或f(ab...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王峰，張世成，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：湖南德米特儀器有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
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