【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及基因檢測(cè)，更特別涉及一種利用長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)檢測(cè) ids基因突變的引物組、試劑盒及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、黏多糖貯積癥ii型（mucopolysaccharidosis?type?ii,?mps?ii,?omim?309900），又稱hunter綜合征，是一種罕見(jiàn)的x連鎖隱性遺傳性溶酶體貯積病。其發(fā)病機(jī)制為 ids基因變異導(dǎo)致艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（iduronate-2-sulfatase,?i2s）的活性缺陷，從而引發(fā)糖胺聚糖（gag）的分解障礙。未能完全分解的gag在機(jī)體多種組織、器官的溶酶體中病理性貯積，進(jìn)而引起多器官、多系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能異常，臨床表現(xiàn)為多系統(tǒng)受累，如發(fā)育遲緩、骨骼異常、心臟和肝臟受損等。
2、 ids基因位于染色體xq28，長(zhǎng)度約為24?kb，共包含9個(gè)外顯子及8個(gè)內(nèi)含子，編碼550個(gè)氨基酸。在其著絲粒遠(yuǎn)端約20?kb處，存在一個(gè)名為 ids2的假基因。 ids2包含兩個(gè)與 ids基因同源的同源區(qū)，其中第一同源區(qū)與 ids基因的外顯子2、3及內(nèi)含子2、3具有高度同源性，第二同源區(qū)與 ids基因的內(nèi)含子7具有高度同源性，因此，易引發(fā)真假基因間的復(fù)雜重排。
3、目前，人類基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)（
4、mps?ii的診斷主要基于臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查及多種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，如尿gag檢測(cè)、i2s酶活性檢測(cè)及 ids基因變異檢測(cè)等。其中，尿gag的定性和定量檢測(cè)有助于mps?ii的初步篩查，i2s酶活性檢測(cè)對(duì)mps?ii的診斷有重要意義。但這兩種方法都存在一定缺陷，一是不能準(zhǔn)確診斷女性攜帶者，因?yàn)榕詳y帶者可能具有與x染色體非隨機(jī)失活相關(guān)的正常i2s酶活性；二是無(wú)法直接獲得 ids基因的具體突變位點(diǎn)。
5、 ids基因變異檢測(cè)是診斷mps?ii及判斷攜帶者的重要依據(jù)。常用檢測(cè)方法包括一代測(cè)序（sanger測(cè)序）和二代測(cè)序（ngs）。一代測(cè)序及二代測(cè)序均可檢測(cè) ids基因的點(diǎn)突變和小片段插入/缺失，但是一代測(cè)序的通量較低，且無(wú)法檢測(cè)未知突變；二代測(cè)序相比一代測(cè)序來(lái)說(shuō)，測(cè)序通量更高，陽(yáng)性檢出率更高，但是由于讀長(zhǎng)有限，無(wú)法檢測(cè) ids基因重排，也無(wú)法有效分辨真假基因。此外，二代測(cè)序技術(shù)中的全外顯子組測(cè)序（wes）不檢測(cè)基因內(nèi)含子，因此易漏檢位于深度內(nèi)含子區(qū)域的基因變異。多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplexligation-dependent?probe?amplification,?mlpa）可以檢測(cè) ids基因的大片段插入/缺失，但是該方法操作繁瑣，無(wú)法同時(shí)檢測(cè)大批量樣品，且存在對(duì)未知突變的漏檢風(fēng)險(xiǎn)，也無(wú)法準(zhǔn)確判斷大片段插入/缺失的準(zhǔn)確重組位點(diǎn)。對(duì)于涉及 ids假基因或其他類型的復(fù)雜重排，通常需要聯(lián)合上述多種方法來(lái)檢測(cè)并確認(rèn)重組位點(diǎn)。
6、目前基于生化檢測(cè)、一代測(cè)序或二代測(cè)序以及mlpa等方法，雖然可以實(shí)現(xiàn) ids基因點(diǎn)突變和大片段缺失檢測(cè)，但仍存在以下幾方面局限性：
7、1、無(wú)法實(shí)現(xiàn)在同一體系內(nèi)同時(shí)檢測(cè) ids基因的所有突變類型，尤其是復(fù)雜基因重排；
8、2、生化檢測(cè)無(wú)法用于女性攜帶者的檢測(cè)，且無(wú)法識(shí)別具體的突變類型；
9、3、一代測(cè)序通量較低；二代測(cè)序由于讀長(zhǎng)有限，無(wú)法檢測(cè) ids基因重排，也無(wú)法有效分辨真假基因，且需結(jié)合不同的建庫(kù)方式綜合檢測(cè)，基本無(wú)法針對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，操作繁瑣且成本較高；
10、4、mlpa只能檢測(cè)少數(shù)的已知點(diǎn)突變及大片段插入/缺失，但存在對(duì)未知突變存的漏檢風(fēng)險(xiǎn)，也無(wú)法判斷大片段插入/缺失的準(zhǔn)確重組位點(diǎn)，且操作繁瑣。
11、因此，開(kāi)發(fā)一種能夠全面、準(zhǔn)確且快速檢測(cè) ids基因突變的新技術(shù)，以彌補(bǔ)現(xiàn)有方法的不足，具有重要的臨床和科研意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于解決現(xiàn)階段黏多糖貯積癥ii型致病基因檢測(cè)覆蓋不全、特定的ngs檢測(cè)流程漏檢以及ngs技術(shù)無(wú)法檢測(cè)基因重排的問(wèn)題。本專利技術(shù)提供了一種基于多重長(zhǎng)片段pcr擴(kuò)增及長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的檢測(cè)方法，通過(guò)設(shè)計(jì)覆蓋 ids基因全長(zhǎng)、假基因 ids2全長(zhǎng)及 ids基因著絲粒近端約1?mb至 ids2基因著絲粒遠(yuǎn)端約1?mb區(qū)域的特異性引物組，實(shí)現(xiàn)對(duì)黏多糖貯積癥ii型致病基因 ids的多種突變（包括點(diǎn)突變、小片段插入/缺失、大片段插入/缺失及結(jié)構(gòu)變異）的全面檢測(cè)。本專利技術(shù)所提供的方法結(jié)合多重長(zhǎng)片段pcr擴(kuò)增與長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的優(yōu)勢(shì)，可以實(shí)現(xiàn)全面、準(zhǔn)確、快速地同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品中mps?ii致病基因 ids相關(guān)的所有突變類型。
2、根據(jù)本專利技術(shù)的第一方面，提供了用于檢測(cè) ids基因突變的引物組，所述引物組包含如下引物：
3、（1）ids-1-f與ids-1-r引物對(duì)，其中所述ids-1-f選自如seq?id?no:?1及seq?idno:?2所示引物中的至少一種，ids-1-r本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.用于檢測(cè)IDS基因突變的引物組，所述引物組包含如下引物：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，所述IDS基因突變包括以下突變中的一種或多種：IDS基因的點(diǎn)突變、小片段插入/缺失及結(jié)構(gòu)變異。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，所述引物組進(jìn)一步包含IDS-Gap?Mix引物組，所述IDS-Gap?Mix引物組包含如SEQ?ID?NO:?19-218所示引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物組，所述IDS基因突變進(jìn)一步包括IDS基因著絲粒近端1Mb至IDS2基因著絲粒遠(yuǎn)端1?Mb區(qū)域內(nèi)的大片段缺失。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的引物組，所述引物組中引物的5’端進(jìn)一步連接有用于區(qū)分不同樣品的DNA條形碼。
6.用于檢測(cè)IDS基因突變的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的引物組。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，所述試劑盒還包括用于長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增的試劑、用于DNA純化的試劑和/或用于構(gòu)建長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序文庫(kù)的試劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，所述用于長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增的試劑包括DNA聚合酶、dNT
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，所述用于構(gòu)建長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序文庫(kù)的試劑包括損傷修復(fù)試劑、末端修復(fù)試劑、標(biāo)簽連接試劑、DNA純化試劑、接頭連接試劑及外切酶中的至少一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，所述長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序文庫(kù)適用于單分子實(shí)時(shí)測(cè)序平臺(tái)或納米孔測(cè)序平臺(tái)。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，所述引物組被混合在單個(gè)反應(yīng)管中提供。
12.根據(jù)權(quán)利要求6-11中任一項(xiàng)所述的試劑盒，所述IDS基因突變包括以下突變中的一種或多種：IDS基因的點(diǎn)突變、小片段插入/缺失、結(jié)構(gòu)變異，以及IDS基因著絲粒近端1?Mb至IDS2基因著絲粒遠(yuǎn)端1?Mb區(qū)域內(nèi)的大片段缺失。
13.用于檢測(cè)IDS基因突變的系統(tǒng)，包括以下模塊：
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的系統(tǒng)，所述受試者來(lái)源的樣品選自生物樣品或由所述生物樣品提取的基因組DNA。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的系統(tǒng)，所述長(zhǎng)片段PCR在單個(gè)反應(yīng)管中完成。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的系統(tǒng)，所述長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序選自單分子實(shí)時(shí)測(cè)序或納米孔測(cè)序。
17.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述突變分析模塊可用于確定以下一種或多種IDS基因突變：IDS基因的點(diǎn)突變、小片段插入/缺失、結(jié)構(gòu)變異，以及IDS基因著絲粒近端1?Mb至IDS2基因著絲粒遠(yuǎn)端1?Mb區(qū)域內(nèi)的大片段缺失。
18.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的引物組或權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備以下任一產(chǎn)品中的應(yīng)用：
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，所述IDS基因突變包括以下突變中的一種或多種：IDS基因的點(diǎn)突變、小片段插入/缺失、結(jié)構(gòu)變異，以及IDS基因著絲粒近端1?Mb至IDS2基因著絲粒遠(yuǎn)端1?Mb區(qū)域內(nèi)的大片段缺失。
...【技術(shù)特征摘要】
1.用于檢測(cè)ids基因突變的引物組，所述引物組包含如下引物：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，所述ids基因突變包括以下突變中的一種或多種：ids基因的點(diǎn)突變、小片段插入/缺失及結(jié)構(gòu)變異。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，所述引物組進(jìn)一步包含ids-gap?mix引物組，所述ids-gap?mix引物組包含如seq?id?no:?19-218所示引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物組，所述ids基因突變進(jìn)一步包括ids基因著絲粒近端1mb至ids2基因著絲粒遠(yuǎn)端1?mb區(qū)域內(nèi)的大片段缺失。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的引物組，所述引物組中引物的5’端進(jìn)一步連接有用于區(qū)分不同樣品的dna條形碼。
6.用于檢測(cè)ids基因突變的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的引物組。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，所述試劑盒還包括用于長(zhǎng)片段pcr擴(kuò)增的試劑、用于dna純化的試劑和/或用于構(gòu)建長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序文庫(kù)的試劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，所述用于長(zhǎng)片段pcr擴(kuò)增的試劑包括dna聚合酶、dntp及反應(yīng)緩沖液中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，所述用于構(gòu)建長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序文庫(kù)的試劑包括損傷修復(fù)試劑、末端修復(fù)試劑、標(biāo)簽連接試劑、dna純化試劑、接頭連接試劑及外切酶中的至少一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，所述長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序文庫(kù)適用于單分子實(shí)時(shí)測(cè)序平臺(tái)或納米孔...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉俊濤，田枝鑫，姚鳳霞，孟萬(wàn)利，張為民，盧玉林，郝娜，趙飛，毛愛(ài)平，陳迪，李淑娟，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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