【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物工程及微生物發酵領域，具體地說，涉及一種生產腺苷菌株的構建方法及其應用。
技術介紹
1、核苷是一類糖苷的總稱。核苷是核酸和核苷酸的組成成分。核苷是由d-核糖或d-z-脫氧核糖與嘧啶堿或嘌呤堿縮合而成。核苷一般為無色結晶，不溶于普通有機溶劑，易溶于熱水，熔點為160～240℃。由d-核糖生成的核苷稱核糖核苷，參與rna組成，由d-α-脫氧核糖生成的核苷稱脫氧核糖核苷，參與dna組成。d-核糖與腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶縮合生成相應的腺嘌呤核糖核苷、鳥嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它們分別簡稱為腺苷(a)、鳥苷(g)、胞苷(c)、胸苷(t)和尿苷(u)。
2、鳥嘌呤核苷(鳥苷)和次黃嘌呤核苷(肌苷)在食品和醫藥行業有著廣泛的作用。在食品領域，鳥苷和肌苷分別是鳥苷酸二鈉和肌苷酸二鈉的重要前體，而鳥苷酸二鈉與肌苷酸二鈉組合使用作為食品增鮮劑，廣泛應用于雞精、醬油等調味品中。在醫藥領域，鳥苷和肌苷可以作為多種抗病毒藥物的醫藥中間體，如無環鳥苷、三氮唑核苷、三磷酸鳥苷鈉等都需要鳥苷作為合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前體，而肌苷酸可以作為合成腺苷酸(amp)和鳥苷酸(gmp)的前體，適用于各種原因引起的白細胞減少癥、血小板減少癥、各種心臟疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外還可治療中心視網膜炎、視神經萎縮等。
3、腺苷即腺嘌呤核苷，化學名為6-氨基-9-β-d-呋喃核糖基-9-氫嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脫磷酸后的產物，屬于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一種遍布人
4、目前，微生物發酵是生產核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌或短小芽孢桿菌等。在生長菌株的選育與改造過程中，通過使用紫外誘變、硫酸二乙酯誘變育種，定向選育核苷高產菌株；或者根據細菌中核苷酸的代謝路徑和調節機理，深入了解菌株遺傳背景及菌株特性，通過代謝工程手段，有目的性地對菌株進行改造，以獲得性狀優良、能夠高產核苷的生產菌株。但目前核苷菌種的發酵性能仍較差、核苷的轉化率仍較低，不能滿足大規模工業化生產的需求。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種生產腺苷菌株的構建方法及其應用。
2、為了實現本專利技術目的，第一方面，本專利技術提供一種修飾的微生物，所述微生物相比于未修飾的微生物，其肌醇轉運蛋白的活性降低或喪失，且所述微生物相比于未修飾的微生物具有增強的腺苷生產能力。
3、本專利技術中，所述肌醇轉運蛋白在ncbi上的參考序列編號為np_391850.2。
4、進一步地，微生物中的肌醇轉運蛋白的活性降低或喪失是由選自以下1)-4)，或任選的組合實現的：
5、1)通過改變所述肌醇轉運蛋白的編碼基因的啟動子序列而降低或喪失；
6、2)通過改變所述肌醇轉運蛋白的氨基酸序列而降低或喪失；
7、3)通過改變編碼所述肌醇轉運蛋白的核苷酸序列而降低或喪失；
8、4)通過敲除所述肌醇轉運蛋白的編碼序列而喪失。
9、進一步地，采用誘變、定點突變或同源重組的方法來降低所述肌醇轉運蛋白的編碼基因的表達或敲除所述肌醇轉運蛋白的編碼基因。
10、在本專利技術的具體實施方式中，肌醇轉運蛋白活性降低或喪失是通過如下a或b來實現的：
11、a、肌醇轉運蛋白的編碼基因的起始密碼子由atg突變為gtg或ttg；
12、b、肌醇轉運蛋白的編碼基因第1111-1113位堿基由tgg突變為taa。
13、所述微生物可以是枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(bacillus?amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(bacillus?pumilus)或大腸桿菌(escherichia?coli)等。例如，出發菌株為b.subtilis?168、b.subtilis?a5(菌株b.subtilis?a5構建方法參見cn110257315b)。
14、第二方面，本專利技術提供生產腺苷菌株的構建方法，所述方法包括：利用基因工程手段，失活或弱化具有核苷生產能力的微生物中的肌醇轉運蛋白的編碼基因。
15、所述弱化選自以下a)-d)，或任選的組合實現的：
16、a)通過改變所述肌醇轉運蛋白的編碼基因的啟動子序列而降低或喪失；
17、b)通過改變所述肌醇轉運蛋白的氨基酸序列而降低或喪失；
18、c)通過改變編碼所述肌醇轉運蛋白的核苷酸序列而降低或喪失；
19、d)通過敲除所述肌醇轉運蛋白的編碼序列而喪失。
20、弱化的方法可選自誘變、定點突變、同源重組等中的至少一種。
21、優選地，弱化是通過如下①或②來實現的：
22、①肌醇轉運蛋白的編碼基因的起始密碼子由atg突變為gtg或ttg；
23、②肌醇轉運蛋白的編碼基因第1111-1113位堿基由tgg突變為taa。
24、第三方面，本專利技術提供按照所述方法構建得到的重組菌。
25、第四方面，本專利技術提供所述微生物或按照所述方法構建得到的重組菌在腺苷或腺苷衍生物發酵生產或提高腺苷或腺苷衍生物發酵產量中的應用。
26、本專利技術所述腺苷衍生物包括但不限于三磷酸腺苷(atp)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷。
27、第五方面，本專利技術提供一種生產腺苷的方法，所述方法包括如下步驟：
28、i)培養所述微生物或按照所述方法構建得到的重組菌，獲得培養物；
29、ii)從步驟i)中獲得的所述培養物中收集所產生的腺苷。
30、借由上述技術方案，本專利技術至少具有下列優點及有益效果：
31、本專利技術提供了一種枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌，其編碼肌醇轉運蛋白的iolf基因經修飾(弱化或失活)后，使得所述菌株生產腺苷的能力與未修飾的菌株相比增強。iolf基因缺失突變、iolf基因起始密碼子修飾突變、iolf基因1111-1113位由tgg突變為taa突變均引起iolf基因轉錄水平下降，同時生產腺苷能力有不同程度的提升，其中iolf基因1111-1113位由tgg突變為taa帶來的生產腺苷能力提升效果最好。
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1.一種修飾的微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修飾的微生物，其肌醇轉運蛋白的活性降低或喪失，且所述微生物相比于未修飾的微生物具有增強的腺苷生產能力；
2.根據權利要求1所述的微生物，其特征在于，微生物中的肌醇轉運蛋白的活性降低或喪失是由選自以下1)-4)，或任選的組合實現的：
3.根據權利要求2所述的微生物，其特征在于，采用誘變、定點突變或同源重組的方法來降低所述肌醇轉運蛋白的編碼基因的表達或敲除所述肌醇轉運蛋白的編碼基因。
4.根據權利要求1所述的微生物，其特征在于，肌醇轉運蛋白活性降低或喪失是通過如下A或B來實現的：
5.根據權利要求1-4任一項所述的微生物，其特征在于，所述微生物為枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacillus?pumilus)或大腸桿菌(Escherichia?coli)。
6.生產腺苷菌株的構建方法，其特征在于，所述方法包括：利用基因工程手段，失活或弱化具有核苷生產能力的微生物中的肌
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，弱化的方法選自誘變、定點突變、同源重組中的至少一種；
8.按照權利要求6或7所述方法構建得到的重組菌。
9.權利要求1-5任一項所述微生物或權利要求8所述重組菌在腺苷或腺苷衍生物發酵生產或提高腺苷或腺苷衍生物發酵產量中的應用；
10.一種生產腺苷的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
...【技術特征摘要】
1.一種修飾的微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修飾的微生物，其肌醇轉運蛋白的活性降低或喪失，且所述微生物相比于未修飾的微生物具有增強的腺苷生產能力；
2.根據權利要求1所述的微生物，其特征在于，微生物中的肌醇轉運蛋白的活性降低或喪失是由選自以下1)-4)，或任選的組合實現的：
3.根據權利要求2所述的微生物，其特征在于，采用誘變、定點突變或同源重組的方法來降低所述肌醇轉運蛋白的編碼基因的表達或敲除所述肌醇轉運蛋白的編碼基因。
4.根據權利要求1所述的微生物，其特征在于，肌醇轉運蛋白活性降低或喪失是通過如下a或b來實現的：
5.根據權利要求1-4任一項所述的微生物，其特征在于，所述微生物為枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳濤，薛婷莉，欒明月，張孟娟，趙津津，
申請(專利權)人：廊坊梅花生物技術開發有限公司，
類型：發明
國別省市：
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