【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程和生物代謝，更具體的說是設計同源片段并導入釀酒酵母saccharomyces?cerevisiaeby4742以改造釀酒酵母的代謝通路，使其能夠生物合成1,4-二羥基-4-萘甲酸(dhna)。
技術介紹
1、基因工程(genetic?engineering)又稱基因拼接技術和dna重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種dna分子，然后導入活細胞，使外源基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯表達的操作，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品。在眾多模式微生物中，釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)因其強大的遺傳工具以及菌株的gras(generallyregarded?assafe)狀態適合大規模的操作而被廣泛用于生物技術行業。與原核生物不同，釀酒酵母作為模式真核生物具有多個細胞器，可以為生物合成提供不同的環境和區室，而且可以表達原核生物不能表達的酶，如細胞色素p450酶等。此外，釀酒酵母對苛刻的工業條件也表現出很高的耐受性。因此，釀酒酵母已被開發為用于代謝工程改造生產來自細菌、真菌和植物物種的天然產物的平臺微生物。
2、目前，以釀酒酵母作為宿主進行代謝工程改造的技術已經在生產特定燃料，化學物質和藥物，如游離脂肪酸、脂肪酸乙酯、脂肪醇和烷烴等脂肪酸和其衍生物；具有重要商業應用價值的萜類化合物，包括被廣泛用作香水成分、食品香料、藥劑和殺蟲劑的單萜類化合物(如：香葉醇、芳樟醇、薄荷醇、熏
3、維生素k統稱為一組脂溶性化合物，含有2-甲基-1，4-萘醌部分，但在3位的類異戊二烯側鏈結構不同。維生素k天然以兩種形式存在，葉醌和一系列甲萘醌(包括mk-4,mk-7等)，這兩種物質都在止血中起重要作用。1,4-二羥基-4-萘甲酸是mk-7的前體，利用釀酒酵母生物合成，為未來在釀酒酵母中生物合成mk-7提供重要影響。
技術實現思路
1、為了解決現有技術的問題，本專利技術提出如下技術方案：
2、一種生物合成1,4-二羥基-2-萘甲酸釀酒酵母菌株的構建方法，其特征是包括如下步驟：在基礎質粒puc19上構建同源臂片段，通過無縫克隆的方式將編碼生物合成dhna的目的基因連接到puc19上，獲得質粒p1，p2，p3，p4，p5，p6，通過聚合酶鏈式反應獲得片段f1，f2，f3，f4，f5，f6，利用酵母轉化方法將6個片段轉入釀酒酵母saccharomyces?cerevisiaeby4742中，獲得一株能夠生物合成1,4-二羥基-2-萘甲酸(dhna)的工程菌株。所述重組工程菌株構建方法。
3、所述重組工程菌株構建方法p1質粒含有來源于釀酒酵母saccharomycescerevisiae?by4742的delta位點上游基因片段delta-up，啟動子ptdh1，終止子ttef1和啟動子ptef1部分片段(200bp)；含有來源于大腸桿菌escherichia?colistr.k-12substr.mg1655的編碼異分支酸合酶基因entc。
4、所述重組工程菌株構建方法p2質粒含有來源于釀酒酵母saccharomycescerevisiae?by4742的啟動子ptef1，終止子tpgk1，終止子ttef1部分片段(202bp)和啟動子ppgk1部分片段(200bp)；含有來源于大腸桿菌escherichia?colistr.k-12substr.mg1655的編碼2-丁酰基-5-烯醇丙酮酸-6-羥基-3-環己烯-1-羧酸合酶mend。
5、所述重組工程菌株構建方法p3質粒含有來源于釀酒酵母saccharomycescerevisiae?by4742的啟動子ppgk1，終止子tcyc1，終止子tpgk1部分片段(199bp)和終止子ttef；含有來源于saccharomyces?cerevisiae?s288c的編碼亮氨酸的leu2基因；含有來源于大腸桿菌escherichia?colistr.k-12substr.mg1655的編碼2-丁酰基-6-羥基2,4-環己二烯-1-羧酸合酶menh。
6、所述重組工程菌株構建方法p4質粒含有來源于釀酒酵母saccharomycescerevisiae?by4742的delta位點下游基因片段delta-down，啟動子ptef1，終止子ttpi1；含有來源于saccharomyces?cerevisiae?s288c的編碼亮氨酸的lue2部分基因(200bp)，啟動子pleu2；含有來源于大腸桿菌escherichia?colistr.k-12substr.mg1655的編碼鄰琥珀酰苯甲酸合成酶menc。
7、所述重組工程菌株構建方法p5質粒含有來源于釀酒酵母saccharomycescerevisiae?by4742的rdna位點上游基因片段rdna-up，啟動子ptdh1，終止子ttef1，啟動子ptef1，終止子tpgk1；含有來源于prs413質粒的編碼組氨酸的his3部分基因(200bp)，啟動子phis3；含有來源于大腸桿菌escherichia?coli?str.k-12substr.mg1655的編碼1,4-二羥基-2-萘酰基-輔酶a合酶基因menb,編碼1,4-二羥基-2-萘基輔酶a水解酶基因meni。
8、所述重組工程菌株構建方法：p6質粒含有來源于釀酒酵母saccharomycescerevisiae?by4742的rdna位點下游基因片段rdna-down，啟動子ppgk1，終止子tcyc1，終止子ttpi1；含有來源于prs413質粒的編碼組氨酸的his3基因；含有來源于大腸桿菌escherichia?coli?str.k-12substr.mg1655的編碼鄰琥珀酰苯甲酸輔酶a連接酶基因mene。
9、所述重組工程菌株構建方法通過對p1，p2，p3，p4質粒進行聚合酶鏈式反應獲取片段f1，f2，f3，f4，導入野生型釀酒酵母saccharomyces?cerevisiae?by4742，形成1株釀酒酵母工程菌bd-0。
10、所述重組工程菌株構建方法通過對p5，p6質粒進行聚合酶鏈式反應獲取片段f5，f6，導入釀酒酵母工程菌bd-0，形成1株釀酒酵母工程菌bd-1。
11、所述重組工程菌株構建方法利用搖床搖瓶培養，分光光度計測量od600，高效液相色譜儀(hplc)測量dhna的產量。
12、本專利技術為了能夠在釀酒酵母內生物合成1,4-二羥本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種生物合成1,4-二羥基-2-萘甲酸釀酒酵母菌株的構建方法，其特征是包括如下步驟：在基礎質粒pUC19上構建同源臂片段，通過無縫克隆的方式將編碼生物合成DHNA的目的基因連接到pUC19上，獲得質粒P1，P2，P3，P4，P5，P6，通過聚合酶鏈式反應獲得片段F1，F2，F3，F4，F5，F6，利用酵母轉化方法將6個片段轉入釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiaeBY4742中，獲得一株能夠生物合成1,4-二羥基-2-萘甲酸的工程菌株。
2.根據權利要求1所述工程菌株構建方法，其特征在于：P1質粒含有來源于釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae?BY4742的delta位點上游基因片段delta-UP，啟動子Ptdh1，終止子Ttef1和啟動子Ptef1部分片段；含有來源于大腸桿菌Escherichia?colistr.K-12substr.MG1655的編碼異分支酸合酶的基因entC。
3.根據權利要求1所述工程菌株構建方法，其特征在于：P2質粒含有來源于釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae?B
4.根據權利要求1所述工程菌株構建方法，其特征在于：P3質粒含有來源于釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae?BY4742的啟動子Ppgk1，終止子Tcyc1，終止子Tpgk1部分片段和終止子Ttef；含有來源于Saccharomyces?cerevisiae?S288C的編碼亮氨酸的LUE2基因；含有來源于大腸桿菌Escherichia?colistr.K-12substr.MG1655的編碼2-丁酰基-6-羥基2,4-環己二烯-1-羧酸合酶的基因menH。
5.根據權利要求1所述工程菌株構建方法，其特征在于：P4質粒含有來源于釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae?BY4742的delta位點下游基因片段delta-DOWN，啟動子Ptef1，終止子Ttpi1；含有來源于Saccharomyces?cerevisiae?S288C的編碼亮氨酸的LUE2部分基因，啟動子Pleu2；含有來源于大腸桿菌Escherichia?colistr.K-12substr.MG1655的編碼鄰琥珀酰苯甲酸合成酶的基因menC。
6.根據權利要求1所述工程菌株構建方法，其特征在于：P5質粒含有來源于釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae?BY4742的rDNA位點上游基因片段rDNA-UP，啟動子Ptdh1，終止子Ttef1，啟動子Ptef1，終止子Tpgk1；含有來源于pRS413質粒的編碼組氨酸的His3部分基因，啟動子Phis3；含有來源于大腸桿菌Escherichia?coli?str.K-12substr.MG1655的編碼1,4-二羥基-2-萘酰基-輔酶A合酶的基因menB和編碼1,4-二羥基-2-萘基輔酶A水解酶的基因menI。
7.根據權利要求1所述工程菌株構建方法，其特征在于：P6質粒含有來源于釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae?BY4742的rDNA位點下游基因片段rDNA-DOWN，啟動子Ppgk1，終止子Tcyc1，終止子Ttpi1；含有來源于pRS413質粒的編碼組氨酸的His3基因；含有來源于大腸桿菌Escherichia?coli?str.K-12substr.MG1655的編碼鄰琥珀酰苯甲酸輔酶A連接酶的基因menE。
8.根據權利要求1所述工程菌株構建方法，其特征在于：通過對P1，P2，P3，P4質粒進行聚合酶鏈式反應獲取片段F1，F2，F3，F4，導入野生型釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiaeBY4742，形成1株釀酒酵母工程菌BD-0。
9.根據權利要求1所述工程菌株構建方法，其特征在于：通過對P5，P6，P7質粒進行聚合酶鏈式反應獲取片段F5，F6，F7，導入釀酒酵母工程菌BD-0，形成1株釀酒酵母工程菌BD-1。
10.根據權利要求1所述重組工程菌株構建方法，其特征在于：利用搖床搖瓶培養，分光光度計測量OD600，高效液相色譜儀測量DHNA的產量。
...【技術特征摘要】
1.一種生物合成1,4-二羥基-2-萘甲酸釀酒酵母菌株的構建方法，其特征是包括如下步驟：在基礎質粒puc19上構建同源臂片段，通過無縫克隆的方式將編碼生物合成dhna的目的基因連接到puc19上，獲得質粒p1，p2，p3，p4，p5，p6，通過聚合酶鏈式反應獲得片段f1，f2，f3，f4，f5，f6，利用酵母轉化方法將6個片段轉入釀酒酵母saccharomyces?cerevisiaeby4742中，獲得一株能夠生物合成1,4-二羥基-2-萘甲酸的工程菌株。
2.根據權利要求1所述工程菌株構建方法，其特征在于：p1質粒含有來源于釀酒酵母saccharomyces?cerevisiae?by4742的delta位點上游基因片段delta-up，啟動子ptdh1，終止子ttef1和啟動子ptef1部分片段；含有來源于大腸桿菌escherichia?colistr.k-12substr.mg1655的編碼異分支酸合酶的基因entc。
3.根據權利要求1所述工程菌株構建方法，其特征在于：p2質粒含有來源于釀酒酵母saccharomyces?cerevisiae?by4742的啟動子ptef1，終止子tpgk1，終止子ttef1部分片段和啟動子ppgk1部分片段；含有來源于大腸桿菌escherichia?colistr.k-12substr.mg1655的編碼2-丁酰基-5-烯醇丙酮酸-6-羥基-3-環己烯-1-羧酸合酶的基因mend。
4.根據權利要求1所述工程菌株構建方法，其特征在于：p3質粒含有來源于釀酒酵母saccharomyces?cerevisiae?by4742的啟動子ppgk1，終止子tcyc1，終止子tpgk1部分片段和終止子ttef；含有來源于saccharomyces?cerevisiae?s288c的編碼亮氨酸的lue2基因；含有來源于大腸桿菌escherichia?colistr.k-12substr.mg1655的編碼2-丁酰基-6-羥基2,4-環己二烯-1-羧酸合酶的基因menh。
5.根據權利要求1所述工程菌株構建方法，其特征在于：p4質粒含有來源于釀酒酵母saccharomyces?cerevisiae?by4742的delta位點...
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