【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物基因工程與代謝工程應用領域，具體涉及一種提高香紫蘇醇生物合成效率的方法。
技術介紹
0、技術背景
1、香紫蘇醇是一種半日花烷型二萜叔醇，作為天然植物香料，廣泛應用于香精香料、醫藥、化妝品、保健品等領域。特別是，作為名貴香料龍涎香的替代品，香紫蘇醇能夠用于合成香紫蘇醇內酯及降龍涎香醚，具有較高的經濟價值和市場應用前景(生物工程學報,2013,29(08):1185-1192)。目前，香紫蘇醇的工業化生產主要依賴于植物提取，但是得率低、生長周期長，而且受地理、環境、氣候等因素影響，嚴重阻礙了香紫蘇醇的工業化生產與應用。因此，急需開發一種全新的香紫蘇醇制備工藝，能夠實現高效、清潔、可再生的生產過程。
2、微生物細胞工廠提供了一種經濟和環保的方法，從可再生、廉價的原料中生產高值化學品，包括生物燃料、精細化學品和藥用化學品等。近年來，隨著功能基因組學、代謝工程和合成生物學的發展，酵母已成為目前一種理想的細胞工廠，廣泛應用于目標產物的生物合成過程(front.bioeng.biotechnol.,2020,8:594347)。因此，酵母細胞工廠有望成為香紫蘇醇合成的全新技術路線。例如，在釀酒酵母中，通過甲羥戊酸途徑系統優化，香紫蘇醇產量提高至403mg/l(metab.eng.2015,27,65-75)。進一步，通過全局轉錄調控靶點改造，產量達到750mg/l(microb.cell?fact.2015,14,60)。相似地，在解脂耶式酵母中，借助系統途徑工程改造，結合兩相發酵條件優化，在5l發
3、盡管目前利用傳統代謝工程改造，例如途徑工程、酶工程等，能夠大幅度提升微生物細胞工廠合成香紫蘇醇能力。但是，現有技術忽視了一個工業生產過程的關鍵問題，即長時間發酵過程的細胞活性以及持續生產能力。而細胞活性通常由細胞壽命，包括復制壽命和時序壽命決定(science,2010,328,321–326)。因此，通過調控細胞壽命能夠使產香紫蘇醇細胞在長時間補料發酵過程維持較高活性以及高效生產能力，同時偶聯途徑工程優化，有望進一步突破香紫蘇醇合成效率，推動其工業化應用過程。
技術實現思路
1、本專利技術的目標是提高目標產物香紫蘇醇的合成效率，進而提出一種提高香紫蘇醇生物合成效率的方法。
2、為實現上述目的，本專利技術采用技術方案為
3、一種提高香紫蘇醇生物合成效率的方法，其特征在于：在宿主菌株中，通過crispr/cas9技術實現基因敲除，或/和導入dna片段，調節菌株代謝途徑得到相應工程菌株；而后利用所得工程菌株進行生物合成獲得香紫蘇醇；
4、所述基因敲除，通過導入含有編碼框上下游同源臂的供體dna實現；
5、所述dna片段從上游到下游依次包括：上游同源臂、啟動子、基因、終止子、下游同源臂；
6、所述宿主菌株選自釀酒酵母中的任一種。
7、通過crispr/cas9技術將以下至少一種壽命調控因子基因敲除；
8、所述壽命調控因子基因包括tor1,sch9,gpa2,gpr1,ras1,ras2,bcy1,tpk1,tpk3,hxt1,hxk2,vhs1,reg1,mig1,ppg1。
9、上述設計利用crispr/cas9系統，將靶基因進行無縫敲除。首先，通過融合pcr方法獲得donor?dna，包括500bp上游同源臂以及500bp下游同源臂；其次，構建靶向目標基因的grna質粒(具體方法可參考專利技術人前期授權專利zl?202010428088.2)；然后，將grna質粒與donor?dna各500ng轉化進入香紫蘇醇合成酵母菌株scx42(metab.eng.,2023,75,19-28)。所獲得轉化子提取基因組dna用于pcr驗證，驗證正確的菌株進行香紫蘇醇發酵。
10、而后將上述獲得菌株進行發酵培養，發酵培養基為含有20g/l葡萄糖的基礎成分培養基，30℃，220rpm培養96h，氣相色譜測定香紫蘇醇產量。
11、在進一步，通過crispr/cas9技術將(a)～(e)中的至少一種dna片段導入至上述調控壽命調控因子基因所獲得菌株作為的宿主菌株中，調節菌株代謝途徑得到相應工程菌株；而后利用所得工程菌株進行生物合成獲得香紫蘇醇；其中，(a)～(e)中的至少一種：
12、(a)將erg8基因導入宿主菌株基因組；
13、(b)將erg19基因導入宿主菌株基因；
14、(c)將idi1基因導入宿主菌株基因組；
15、(d)將erg12基因導入宿主菌株基因組；
16、(e)將efmvae和efmvas基因同時導入宿主菌株基因組。
17、再進一步的說，通過crispr/cas9技術將(a)～(c)中的至少一種dna片段導入宿主菌株中，調節菌株代謝途徑得到相應工程菌株；而后利用所得工程菌株進行生物合成獲得香紫蘇醇；其中，(a)～(c)中的至少一種：
18、(a)將acs1,2基因導入宿主基因組；
19、(b)將ald6基因導入宿主基因；
20、(c)將adh2基因導入宿主基因。
21、上述，(a)將acs1,2基因導入宿主基因組的x-3位點；
22、(b)將ald6基因導入宿主基因組的ix-2位點；
23、(c)將adh2基因導入宿主基因組的ix-2位點；
24、所述(a)獲得工程菌株使用強組成型啟動子ptef1，所述(b)獲得工程菌株使用強組成型啟動子ptef1，所述(c)獲得工程菌株使用下述任意一種啟動子，啟動子為強組成型啟動子ptdh3、乙醇誘導型啟動子pssa1、低濃度葡萄糖響應型啟動子phxt7。
25、所述宿主菌株為釀酒酵母中的任一種或上述記載至少一種dna片段所獲得菌株。
26、再更進一步的，通過crispr/cas9技術將(a)～(e)中的至少一種dna片段導入宿主菌株中，調節菌株代謝途徑得到相應工程菌株；而后利用所得工程菌株進行生物合成獲得香紫蘇醇；其中，(a)～(e)中的至少一種：
27、(a)以高濃度葡萄糖響應型啟動子phxt1啟動erg9基因表達；
28、(b)以內源erg9啟動子perg9啟動erg9基因表達；
29、(c)以移除了上游激活序列的內源erg9啟動子perg9-δuas啟動erg9基因表達；
30、(d)以甲硫氨酸抑制型啟動子pmet3啟動erg9基因表達；
31、(e)將erg9基因與蛋白降解標本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種提高香紫蘇醇生物合成效率的方法，其特征在于：在宿主菌株中，通過CRISPR/Cas9技術實現基因敲除，或/和導入DNA片段，調節菌株代謝途徑得到相應工程菌株；而后利用所得工程菌株進行生物合成獲得香紫蘇醇；
2.根據權利要求1所述提高香紫蘇醇生物合成效率的方法，其特征在于：通過CRISPR/Cas9技術將以下至少一種壽命調控因子基因敲除；
3.根據權利要求1或權利要求2所述提高香紫蘇醇生物合成效率的方法，其特征在于：通過CRISPR/Cas9技術將(a)～(e)中的至少一種DNA片段導入至上述調控壽命調控因子基因所獲得菌株作為的宿主菌株中，調節菌株代謝途徑得到相應工程菌株；而后利用所得工程菌株進行生物合成獲得香紫蘇醇；其中，(a)～(e)中的至少一種：
4.根據權利要求3所述提高香紫蘇醇生物合成效率的方法，其特征在于：通過CRISPR/Cas9技術將(a)～(c)中的至少一種DNA片段導入宿主菌株中，調節菌株代謝途徑得到相應工程菌株；而后利用所得工程菌株進行生物合成獲得香紫蘇醇；其中，(a)～(c)中的至少一種：
5.根據權利
6.根據權利要求4所述提高香紫蘇醇生物合成效率的方法，其特征在于：所述宿主菌株為釀酒酵母中的任一種或上述權利要求3記載至少一種DNA片段所獲得菌株。
7.根據權利要求1所述提高香紫蘇醇生物合成效率的方法，其特征在于：通過CRISPR/Cas9技術將(a)～(e)中的至少一種DNA片段導入宿主菌株中，調節菌株代謝途徑得到相應工程菌株；而后利用所得工程菌株進行生物合成獲得香紫蘇醇；其中，(a)～(e)中的至少一種：
8.根據權利要求7所述提高香紫蘇醇生物合成效率的方法，其特征在于：所述宿主菌株為釀酒酵母中的任一種或上述權利要求7記載至少一種DNA片段所獲得菌株。
9.一種權利要求1所述的方法構建得到的工程菌。
10.一種權利要求9所述的工程菌的應用，其特征在于：所述工程菌在制備香紫蘇醇中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種提高香紫蘇醇生物合成效率的方法，其特征在于：在宿主菌株中，通過crispr/cas9技術實現基因敲除，或/和導入dna片段，調節菌株代謝途徑得到相應工程菌株；而后利用所得工程菌株進行生物合成獲得香紫蘇醇；
2.根據權利要求1所述提高香紫蘇醇生物合成效率的方法，其特征在于：通過crispr/cas9技術將以下至少一種壽命調控因子基因敲除；
3.根據權利要求1或權利要求2所述提高香紫蘇醇生物合成效率的方法，其特征在于：通過crispr/cas9技術將(a)～(e)中的至少一種dna片段導入至上述調控壽命調控因子基因所獲得菌株作為的宿主菌株中，調節菌株代謝途徑得到相應工程菌株；而后利用所得工程菌株進行生物合成獲得香紫蘇醇；其中，(a)～(e)中的至少一種：
4.根據權利要求3所述提高香紫蘇醇生物合成效率的方法，其特征在于：通過crispr/cas9技術將(a)～(c)中的至少一種dna片段導入宿主菌株中，調節菌株代謝途徑得到相應工程菌株；而后利用所得工程菌株進行生物合成獲得香紫蘇醇；其中，(a)～(c)中的至少一種：
5.根據權利要求4所述提高香紫蘇醇生物合成效率的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：周雍進，高教琪，高寧，趙云現，胡江林，楊志彬，
申請(專利權)人：中國科學院大連化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。